Detta protokoll ger en steg-för-steg-förfarande för att upptäcka strålning-inducerad högborgar för reparation proteiner genom immunofluorescens färgning i mänskliga kolon cancer cellinjer efter bestrålning med neutron-blandade strålen. Immunofluorescens imaging är en känslig metod och ger visuella bevis för utseendet på reparation utbildningsavsnitt proteiner i högborgar som svar på DNA skadliga-agenter, som joniserande strålning. Neutron-blandad stråle används vid behandling med borutroninfångning, BNCT, och det strålningsinducerade DNA-skadesvaret har inte fastställts fullt ut.
Vårt protokoll kan också vara användbart för analys av biologiska effekter på cellnivå på grund av strålning av andra high-LET balkar, som protoner med hjälp av protonstrålterapi eller koljoner med hjälp av hadronterapi. Efter bestrålning, ta bort mediet från de bifogade cellerna, och tvätta dem en gång med 2,5 milliliter PBS. Fixera sedan cellerna med en milliliter av 70%etanol i 10 minuter.
För att permeabilisera cellerna, ta bort etanol, och tvätta dem med 2,5 milliliter PBS. Tillsätt försiktigt en milliliter på 2%Triton X-100 i PBS för att täcka täckkläckorna och inkubera cellerna i fem minuter i rumstemperatur. Tvätta cellerna tre gånger med PBS, och blockera permeabiliseringen med en milliliter på 2%BSA utspädd i PBS.
Inkubera sedan cellerna i minst 30 minuter med 2%BSA. För att färga cellerna, tillsätt rätt mängd primär antikropp utspädd i PBS med BSA, som rekommenderas i textmanuskriptet. Täck sedan Petri-skålen, och placera den i en plastlåda med återfuktad lignin för att bibehålla luftfuktigheten.
Inkubera den i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Efter inkubationen, utför tre tvättar med PBS, och tillsätt rätt mängd sekundär antikropp. Återgå skålen till plastlådan med återfuktad lignin, och inkubera den i minst 30 minuter vid 37 grader Celsius.
Upprepa sedan tvättarna med PBS, och tillsätt 100 mikroliter DAPI utspädd till en slutlig koncentration av ett mikrogram per milliliter för att motverka kärnorna. Inkubera cellerna i högst två minuter vid rumstemperatur, och upprepa tvättarna med PBS. Efter den sista tvätten, ta bort PBS, och försiktigt sätta ett täckskydd ovanpå monteringsmediet, undvika bildandet av luftbubblor.
Täta kanterna på täckplattan med nagellack, och låt monteringsmediet härda innan du utför fluorescensmikroskopi. Gamma-H2AX högborgar, som är standardmarkörer för DNA dubbelsträngade raster, upptäcktes i neutron-blandade, beam-bestrålade och icke-bestrålade kolon cancerceller. Högborgen visas som distinkt fluorescerande prickar.
En högre diameter av gamma-H2AX högborgar observerades i de bestrålade cellerna. Dessutom upptäcktes ett enda spår av en hög-LET alfa partikel korsar kärnorna. Immunofluorescens mikroskopi användes för att upptäcka representativa reparera proteiner Rad52 och DNA-beroende protein kinas.
Ett högt medelvärde för DNA-beroende protein kinase högborgar diameter mättes vid DNA-brott efter bestrålning i jämförelse med kontroll celler. Klustrade DNA dubbelsträngade raster observerades i bestrålade celler som mer komplexa, större och klustrade högborgar med högre intensitet. Det viktigaste steget av immunofluorescensfärgning är fixering av celler och permeabilisering av cellmembranet.
Dessa steg krävs för att antikroppar enkelt tränga in i både dessa celler och intracellulära reparation proteiner. Denna procedur ger information om aktiveringen av varje reparationsväg på cellnivå. Resultaten ska sedan bekräftas på molekylär nivå med hjälp av en analys, såsom realtids-PCR.
Denna teknik gör det möjligt för forskare att utforska strålningsinducerad DNA-skada svar, som inte har helt fastställts i fråga om olika balkar med hjälp av anticancer terapier.