Ce protocole permet aux graines d’être tranchées intactes afin qu’elles ne s’effritent pas, ce qui permet de visualiser les granules d’amidon dans n’importe quelle graine pouvant tenir dans une pointe de pipette. Le cône en plastique malléable soutient la structure native des tissus et des organes secs, de sorte que ce collecteur bon marché et facile permet de traiter de nombreux échantillons en peu de temps. Pour aller de l’avantage de la microscopie médico-légale ici, l’amidon résistant, quelque chose que nous recherchons tous, l’accessibilité des enzymes à cet amidon brut, l’amylolyse, l’indice glycémique et les pics de glucose, ce sont des paramètres clés pour la sélection de meilleures variétés de riz pour lutter contre le diabète de type 2 dans le monde entier aujourd’hui.
Et maintenant, c’est un grand plaisir de vous présenter le Dr Kiah Barton. La Dre Barton vient de notre laboratoire et elle utilisera l’installation d’imagerie de base de la faculté pour vous montrer comment cette technique est déployée. Commencez par décortiquer les grains secs.
Placez un seul noyau sur un bouchon en caoutchouc plat sur un établi et assurez-vous que ce bouchon reste immobile. Utilisez un deuxième bouchon en caoutchouc plat pour abraser le noyau en le tordant contre le premier bouchon en caoutchouc, puis retirez les enveloppes du noyau, en prenant soin de ne pas briser l’endosperme ni broyer les graines trop agressivement entre les deux bouchons en caoutchouc. Retirez toutes les enveloppes restantes à l’aide de pinces fines et insérez un noyau décortiqué individuel dans une pointe de pipette en plastique de 250 microlitres.
Assurez-vous que l’extrémité embryonnaire du noyau est orientée vers l’extrémité conique de la pointe de la pipette. Insérez une deuxième pointe de pipette de 250 microlitres pour forcer le noyau dans la première pointe de pipette et pour garder le noyau immobile pendant le sectionnement, en prenant soin de ne pas endommager le noyau ou plier la deuxième pointe de pipette. Posez l’assemblage de la pointe de la pipette à plat sur un établi et maintenez-le en place à la main.
D’autre part, utilisez une lame de scalpel tranchante pour trancher à travers le centre du noyau, en coupant l’extrémité de la pointe de la pipette. Tranchez vers le bas à travers l’assemblage, puis orientez la lame du scalpel verticalement afin que les deux nouvelles faces exposées de la section de la main soient parallèles. Ensuite, utilisez le scalpel pour couper des sections d’un millimètre d’épaisseur du grain de riz.
Pour effectuer une microscopie à lumière réfléchie, placez les sections transversales de riz sur un morceau de papier noir de calibre lourd. Obtenez des images lumineuses des sections transversales à l’aide d’un stéréomicroscope avec des cols de cygne montés pour un éclairage oblique, en utilisant un grossissement d’au moins 10 fois. Les sections Nipponbare et ssg1 de type sauvage ont été examinées sous 260 fois, 920 fois et 4 200 fois les grossissements.
Lorsqu’elles étaient bien préparées, les sections de riz avaient environ 0,9 millimètre d’épaisseur avec un éclatement minimal de l’endosperme et des couches intactes de péricarpe et d’aleurone. Cette technique permet la préparation de sections de qualité suffisante pour observer l’ensemble de la cellule endosperme, des granules d’amidon composés et des sous-granules individuels. Les producteurs de grains translucides, tels que la lignée hybride d’amidon résistant de type sauvage, Zhehui 7954 et le mutant RS111 généré par le cobalt, ont produit des granulés d’amidon polyédrique étroitement emballés, qui est le phénotype normal de l’endosperme de riz.
Les images SEM des producteurs de noyaux crayeux, variétés commerciales Ye Tang et RS4, montraient des granulés d’amidon ronds et lâchement emballés. Xiushiu 11 de type sauvage et son mutant KMD1, qui exprimait le gène Cry1Ab pour inhiber la prédation des insectes, avaient des sections et des morphotypes d’endospermes similaires aux lignées d’amidon translucides résistantes. Cette technique peut être appliquée aux graines d’autres espèces.
Le modèle monocotylédone, Brachypodium distachyon, produit des graines très dures, mais il était encore possible d’obtenir une section transversale intacte. Des sections transversales intactes ont également été produites à partir de blé d’hiver blanc et tendre. Cette méthode de dépistage rapide et bon marché pour examiner l’intérieur des structures biologiques peut être appliquée aux pattes d’insectes, aux épis de haricots locus, aux aubépines, aux épines de poisson ou à tout domaine de la microscopie médico-légale pouvant bénéficier de cette configuration de support d’échantillon.
Après avoir effectué ce protocole, le revêtement de pulvérisation pour l’électromicroscopie, la coloration avec des colorants fluorescents spécifiques et l’application de calcafluor pour tacher une épaisseur de paroi cellulaire bêta-glucane dans les lignées mutantes d’avoine et d’orge sont des moyens rapides d’aborder la sélection végétale avec un criblage rapide du phénotype.
