Este protocolo permite que las semillas se corten intactas para que no se desmoronen, lo que permite la visualización de gránulos de almidón en cualquier semilla que pueda caber en una punta de pipeta. El cono de plástico maleable soporta la estructura nativa de los tejidos y órganos secos, por lo que este colector barato y fácil permite procesar muchas muestras en poco tiempo. Para pasar de la ventaja de la microscopía forense aquí, el almidón resistente, algo que todos estamos buscando, la accesibilidad de las enzimas a ese almidón crudo, la amilólisis, el índice glucémico y los picos de glucosa, estos son parámetros centrales para criar mejores variedades de arroz para combatir la diabetes tipo 2 en todo el mundo hoy en día.
Y ahora es un gran placer presentarle al Dr. Kiah Barton. Barton es de nuestro laboratorio y utilizará la instalación de imágenes central de la facultad para mostrarle cómo se implementa esta técnica. Comience descascarillando los granos secos.
Coloque un solo grano en un tapón de goma plano en un banco de trabajo y asegúrese de que este tapón permanezca estacionario. Use un segundo tapón de goma plano para desgastar el grano girándolo contra el primer tapón de goma, luego retire las cáscaras del grano, teniendo cuidado de no romper el endospermo ni moler las semillas demasiado agresivamente entre los dos tapones de goma. Retire las cáscaras restantes con pinzas finas e inserte un grano descascarillado individual en una punta de pipeta de plástico de 250 microlitros.
Asegúrese de que el extremo embrionario del grano esté orientado hacia el extremo cónico de la punta de la pipeta. Inserte una segunda punta de pipeta de 250 microlitros para forzar el núcleo en la primera punta de pipeta y mantener el núcleo inmóvil durante la sección, teniendo cuidado de no dañar el núcleo ni doblar la segunda punta de pipeta. Coloque el conjunto de la punta de la pipeta plano en un banco de trabajo y manténgalo en su lugar con la mano.
Con la otra mano, use una cuchilla de bisturí afilada para cortar a través del centro del grano, cortando el extremo de la punta de la pipeta. Corte hacia abajo a través del ensamblaje y luego oriente la hoja del bisturí verticalmente para que las dos nuevas caras expuestas de la sección de la mano sean paralelas. Luego use el bisturí para cortar secciones de un milímetro de grosor del grano de arroz.
Para realizar la microscopía de luz reflejada, coloque las secciones transversales de arroz en un trozo de papel negro de calibre pesado. Obtenga imágenes de luz de las secciones transversales utilizando un microscopio estereoscópico con cuellos de cisne montados para una iluminación oblicua, utilizando al menos 10 veces el aumento. Las secciones de Nipponbare y ssg1 de tipo salvaje se examinaron bajo aumentos de 260 veces, 920 veces y 4, 200 veces.
Cuando se prepararon adecuadamente, las secciones de arroz tenían aproximadamente 0,9 milímetros de grosor con una ruptura mínima del endospermo y capas intactas de pericarpio y aleurona. Esta técnica permite la preparación de secciones de calidad suficiente para observar toda la célula del endospermo, gránulos compuestos de almidón y subgránulos individuales. Los productores de granos translúcidos, como la línea híbrida de almidón resistente de tipo salvaje, Zhehui 7954 y el mutante RS111 generado por cobalto, produjeron gránulos de almidón poliédrico apretados, que es el fenotipo normal de endospermo de arroz.
Las imágenes SEM de los productores de granos de tiza, la variedad comercial Ye Tang y RS4, mostraban gránulos de almidón que eran redondos y vagamente empaquetados. Xiushiu 11 de tipo salvaje y su mutante KMD1, que expresó el gen Cry1Ab para inhibir la depredación de insectos, tenían secciones y morfotipos de endospermo similares a las líneas de almidón resistente translúcido. Esta técnica se puede aplicar a semillas de otras especies.
El modelo monocotiledónea, Brachypodium distachyon, produce semillas muy duras, pero aún así fue posible obtener una sección transversal intacta. Las secciones transversales intactas también se produjeron a partir de trigo de invierno suave y blanco. Este método de detección rápido y barato para mirar dentro de las estructuras biológicas se puede aplicar a patas de insectos, espigas de árboles de locus bean, espinos, espinas de peces o cualquier campo de microscopía forense que pueda beneficiarse de esta configuración de soporte de muestra.
Después de realizar este protocolo, el recubrimiento por pulverización para electromicroscopía, la tinción con colorantes fluorescentes específicos y la aplicación de calcafluor para teñir un espesor de pared celular de beta glucano en líneas mutantes de avena y cebada son algunas formas rápidas de abordar el fitomejoramiento con detección rápida de fenotipos.
