Name: quantitation of rabies virus in various bovine brain structures
Uploaded: 2021-05-22T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Agricultural, Forestry, and Livestock Research (INIFAP) unterstützt. Wir danken Jerzayn Fraustro Esquivel für seine Mitarbeit bei der Entwicklung des Videos, das mit diesem Dokument verbunden ist.

Diese Studie wurde von den Empfehlungen des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung (IACUC) des Centro Nacional de Investigacion Disciplinaria en Microbiologa Animal (CENID-MA) genehmigt und in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen für die Verwendung von Tieren durchgeführt.
1. Proben
<ol><li>Verwenden Sie verschiedene Bereiche des Gehirns, die von 6 verschiedenen tollwut-positiven Rinderhirnen für die RT-PCR-Analyse seziert wurden.</li>
</ol><p class="jove_t...

<ol>
	<li>Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+diagnosis+of+human+rabies:+recent+advances.">Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances.</a> ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).</li><li>. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html">https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html</a> (2019)</li><li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+antibody+technique+in+rabies.">The fluorescent antibody technique in rabies.</a> Laboratory techniques in rabies. , (1996).</li><li>Prabhu, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+comparative+evaluation+of+fluorescent+antibody,+immunohistochemistry,+and+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+tests+for+the+detection+of+rabies+virus+antigen+or+nucleic+acid+in+brain+samples+of+animals+suspected+of+rabies+in+India.">Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India.</a> Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).</li><li>Woldehiwet, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+laboratory+advances+in+the+detection+of+rabies+virus.">Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus.</a> Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).</li><li>Singh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+-+epidemiology,+pathogenesis,+public+health+concerns+and+advances+in+diagnosis+and+control:+a+comprehensive+review.">Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review.</a> Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).</li><li>David, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+RT-PCR+method+in+ante-mortem+&amp;+post-mortem+rabies+diagnosis.">Role of the RT-PCR method in ante-mortem &amp; post-mortem rabies diagnosis.</a> Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).</li><li>Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+for+the+diagnosis+of+human+rabies.">Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies.</a> Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).</li><li>Wacharapluesadee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+detection+of+rabies+RNA+by+NASBA,+real-time+PCR+and+conventional+PCR.">Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR.</a> Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+ante+mortem+and+post-mortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+multiple+strains+of+rabies+virus+RNA+using+primers+designed+to+target+Mexican+vampire+bat+variants.">Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants.</a> Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).</li><li>Dedkov, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+RT-qPCR+assay+for+fast+and+sensitive+rabies+diagnosis.">Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).</li><li>Boldbaatar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+rabies+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).</li><li>Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hern&#225;ndez-Baumgarten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+to+determine+the+stability+of+rabies+virus+genome+in+brains+kept+at+room+temperature.">Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).</li><li>Dacheux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+combined+Real-Time+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+assay+for+the+diagnosis+of+Lyssavirus+infection.">Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).</li><li>Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentos+de+la+reacci&#243;n+en+cadena+de+la+polimerasa+(PCR)+y+de+la+PCR+en+tiempo+real.">Fundamentos de la reacci&#243;n en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.</a> Investigigaci&#243;n en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).</li><li>Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE Available from: <a target="_blank" href="https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p">https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p</a> (2018)</li><li>Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ante-and+post-mortem+diagnosis+of+rabies+using+nucleic+acid-amplification+tests.">Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests.</a> Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).</li><li>Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2017)</li><li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+antibody+technique+in+rabies.">The fluorescent antibody technique in rabies.</a> Laboratory techniques in rabies. , (1996).</li><li>Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hern&#225;ndez, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecci&#243;n+de+un+virus+r&#225;bico+de+origen+vampiro+para+utilizarse+como+cepa+de+desaf&#237;o+en+bovino.">Selecci&#243;n de un virus r&#225;bico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desaf&#237;o en bovino.</a> Veterinaria M&#233;xico. 20, 271-275 (1989).</li><li>Mendez-Ojeda, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rabies+virus+in+organs+unrelated+to+the+central+nervous+system+of+experimentally+inoculated+vampire+bats.">Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats.</a> Revista M&#233;xicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).</li><li>Carneiro, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+virus+RNA+in+naturally+infected+vampire+bats,+Northeastern+Brazil.">Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil.</a> Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).</li><li>Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+molecular+typing+of+rabies+virus+in+samples+stored+in+inadequate+conditions.">Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions.</a> The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).</li><li>Finke, S., Cox, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transcription+attenuation+of+rabies+virus+genes+by+intergenic+regions:+generation+of+recombinant+viruses+overexpressing+the+polymerase+gene.">Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rabies. 3, 1-18 (2017).</li><li>Bingham, J., Van Der, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+rabies+antigen+in+infected+brain+material:+determining+the+reliability+of+different+regions+of+the+brain+for+the+rabies+fluorescent+antibody+test.">Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test.</a> Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).</li></ol>

Frühere Studien haben gezeigt, dass DFA RABV nur innerhalb von sieben Tagen nach der Lagerung der Probe bei Raumtemperatur (21 °C)14erkennen kann. Im Gegensatz dazu zeigte diese Arbeit, dass die Empfindlichkeit von RT-PCR abnimmt, nachdem die Proben 12 Tage lang der Raumtemperatur ausgesetzt waren. Daher kann das RABV-Genom mit qRT-PCR in Proben nachgewiesen werden, die bis zu 23 Tage raumtemperaturexponiert sind. Dies zeigt, dass die Empfindlichkeit von qRT-PCR bei stärker zersetzten Proben re...

Tollwut kann ante-mortem und post-mortem durch verschiedene Techniken bestätigt werden, die den Nachweis von viralen Nukleinsäuren im Gehirn, Haut, Urin oder Speichel ermöglichen1. Der Nachweis des Tollwutvirus-Nukleoprotein (N) Wird vor allem für die Tollwutdiagnose durch molekulare Tests verwendet. Dieses Gen wird auch für die virale Genotypisierung verwendet. Tollwut kann bei Tieren mit jedem Teil des betroffenen Gehirns diagnostiziert werden; Um jedoch die Möglichkeit von Tollwut auszuschließen, muss Gewebe aus mindestens zwei Regionen im Gehirn getestet werden2. Es gibt mehrere diagnostische Methoden für den Tollwutnachweis bei Tieren; der direkte Immunfluoreszenztest bleibt jedoch die Standard-Referenztechnik3. Andere Tests umfassen biologische Tests, die Maus-Impfung, Infektion in der Gewebekultur und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)4. Alle diese Techniken werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) zur Diagnose von Tollwut bei Mensch und Tierempfohlen.
Nukleinsäurenachweis- und -amplifikationstechniken haben die Tollwutdiagnose in den letzten Jahren revolutioniert6 und diese Techniken spielen eine wichtige Rolle bei der Ante-mortem-Diagnose menschlicher Tollwut. Mehrere PCR-basierte Tests wurden als Ergänzung zu herkömmlichen Tests für Anti-Mortem- und Post-Mortem-Tollwut-Diagnosen 7,8,9,10ausgewertet. Die meisten Assays zielen auf das virale Nukleoproteingen tollwutium, das die am höchsten konservierte Region im viralen Genom1,11ist. In den letzten 20 Jahren wurden verschiedene molekulare Assays entwickelt, um RABV zu diagnostizieren, und einige dieser Assays wurden für die Viruscharakterisierung verwendet. Die meisten Studien zielten darauf ab, konservierte Gene innerhalb des viralen Genoms zu detektieren, am häufigsten mithilfe konventioneller oder quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Assays12,13.
PCR ist eine hochempfindliche diagnostische Technik, die das Genom eines bestimmten Krankheitserregers im Gewebe erkennen kann, auch wenn diese Gewebe zersetzt werden. Mit PCR-basierten Ansätzen können minimale Mengen eines infektiösen Erregers in einer klinischen Probe durch die selektive und sich wiederholende Amplifikation einer DNA-Nukleotidsequenz14nachgewiesen werden. qRT-PCR, die fluoreszierende Sonden (z. B. TaqMan) oder DNA-Bindende Farbstoffe (z. B. SYBR Green) enthält, wurde in Studien zur Diagnose von RABV sowohl ante- als auch post- mortem mit hoher Empfindlichkeit verwendet; ein solcher Ansatz erfordert jedoch eine spezielle Ausrüstung. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde reverse transkription-Loop-vermittelte isothermale Amplifikation (RT-LAMP) vorgeschlagen, basierend auf seinen niedrigen Kosten, Einfachheit und wünschenswerten Eigenschaften für die Erkennung von RABV. Dieser Test ist besonders wichtig, da er in Entwicklungsländern verwendet werden kann15.
qRT-PCR basiert auf der Detektion und Quantifizierung eines Moleküls, bei dem die Fluoreszenzsignalerhöhungen in direktem Verhältnis zur Menge des PCR-Produkts in einer einzigen Reaktion stehen. Mit zunehmender Anzahl von Kopien des Nukleinsäureziels steigt auch die Fluoreszenz. Unspezifische interkalierende Farbstoffe wie der SYBR Green DNA-Bindender Farbstoff oder sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonden mit einem Fluorophor und einem Quencher werden häufig verwendet, um die fluoreszierende Auslesung in qRT-PCR bereitzustellen. Dieser Test bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen RT-PCR, die eine kürzere Testzeit (2–4 h), ein geringeres Kontaminationsrisiko durch das geschlossene Rohrsystem (fehlende Post-PCR-Manipulation von verstärkten Produkten) und die Fähigkeit, verschiedene Ziele gleichzeitig zuerkennen, 16umfassen. qRT-PCR kann verwendet werden, um Tollwut ante-mortem aus Speichel und anderen Proben zu diagnostizieren. Dieser Assay kann auch als universeller Echtzeittest für den Nachweis verschiedener Lyssavirus-Arten oder Abstammungen von RABV15verwendet werden. Bei diesem Combo RT-PCR-Ansatz werden zwei Reaktionen verwendet. Die erste detektiert verschiedene genetische Linages von RABV, die zweite die Lyssavirus-Arten. Beide Schritte beinhalten qRT-PCR-Assays, wobei der erste Hybridisierungssonden und der zweite Farbstoff15verwendet. Aufgrund der Vielzahl von Tests, die eine erfolgreiche molekulare Detektion von RABV mit dieser Technik nachgewiesen haben, empfiehlt das aktuelle OIE Terrestrial Manual (2018) den Einsatz von PCR für den molekularen Nachweis von RABV17.
Mexiko ist ein Land mit erheblichem Viehpotenzial. Die Staaten mit der höchsten Viehproduktion enthalten sowohl feuchte tropische Regionen als auch trockene Regionen, die durch das Vorhandensein der Vampirfledermaus Desmodus rotundus, dem Hauptsender der Tollwut, für Tollwutausbrüche gefährdet sind. Daher ist es wichtig, mehr Instrumente zur Verhütung und Bekämpfung von rinderparalytischer Tollwut (BPR) in Mexiko zu entwickeln. Auf dieser Grundlage bestand das Ziel dieser Studie darin, die quantitative qRT-PCR zu verwenden, um die Anzahl der virusfreien Partikel in verschiedenen anatomischen Strukturen von Rinderhirnen nach dem Tod durch Tollwutinfektion zu bestimmen.
Sechs Gehirne, die von RABV-positiven Rindern gewonnen wurden, wurden von einem externen Labor für den Einsatz bei der Entwicklung des unten beschriebenen qRT-PCR-Protokolls gespendet. Die Rinderstrukturproben wurden kaltkett in die INIFAP CENID-MA Laboranlage BSL-2 transportiert und bis zum Gebrauch bei -80 °C gelagert. Die Gehirne wurden von Tieren aus den Bundesstaaten Campeche, Yucatén und Querétaro gewonnen. Vor der Quittung wurden verschiedene Strukturen aus dem Gehirn seziert. Zu diesen Strukturen gehörten das Ammonhorn, Kleinhirn, Kortex, Medulla, Pons und Thalamus18,19. Genetisches Material wurde wie unten beschrieben extrahiert. Die RABV-Diagnose wurde mit direkten fluoreszierenden Antikörpern (DFA)20bestätigt. Als positiv zu steuernde, Mausgehirne, die mit RABV21 geimpft wurden, wurden verwendet. Zusätzlich wurden vier RABV-negative Rinderhirne (wie von DFA bestimmt) als Negativkontrollen verwendet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C7559</td>
			<td>Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-500</td>
			<td>Zimo</td>
			<td>D4031</td>
			<td>The DNA Clean &#38; Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 &#181;g of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>193-500</td>
			<td>Purification of nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3553400001</td>
			<td>High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelDoc XR</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>XR+</td>
			<td>Analyzes larger protein and DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCycler Thermal Cycler Gradient</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>582BR</td>
			<td>Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725141</td>
			<td>Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0918-500</td>
			<td>Precipitation of nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td>QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>28025-021</td>
			<td>Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary 
			DNA strand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td>Microvolume Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)18 primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SO132</td>
			<td>The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5&#39;- and 3&#39;-hydroxyl ends.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td>In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#EP0402</td>
			<td>Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5&#8217; and 3&#8217; synthesis of DNA 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of rabies virus in various bovine brain structures

Rinder-Paralytische Tollwut (BPR) ist eine Form der viralen Enzephalitis, die in ganz Lateinamerika von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung ist und ein großes Zoonoserisiko darstellt. Hier galt es, mithilfe eines Laborprotokolls die relative Kopiernummer des Tollwutvirus-Genoms (RABV) in verschiedenen anatomischen Rinderhirnstrukturen mithilfe quantitativer Realzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) zu bestimmen. qRT-PCR quantifiziert die spezifische Anzahl der Genkopien, die in einer Probe auf der Grundlage der nach der Amplifikation emittierten Fluoreszenz vorhanden sind und direkt proportional zur Menge der in der Probe vorhandenen Zielnukleinsäure sind. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner kurzen Dauer, des reduzierten Kontaminationsrisikos und des Potenzials, virale Nukleinsäuren in verschiedenen Proben leichter als andere Techniken zu erkennen, von Vorteil. Die Gehirne von sechs tollwütigen Tieren wurden in sechs anatomische Strukturen unterteilt, nämlich das Ammonhorn, Kleinhirn, Kortex, Medulla, Pons und Thalamus. Alle Gehirne wurden auf der Grundlage eines direkten Immunfluoreszenztests als positiv für RABV-Antigene identifiziert. Die gleichen anatomischen Strukturen aus den Gehirnen von vier RABV-negativen Rindern wurden ebenfalls bewertet. DIE RNA wurde aus jeder Struktur extrahiert und für qRT-PCR verwendet. Ein Test wurde durchgeführt, um die Kopiennummern von RABV-Genen unter Verwendung eines in vitro transkribierten Nukleoprotein-Gens zu bestimmen. Die Standardkurve zur Quantifizierung viraler RNA wies eine Effizienz von 100% und eine Linearität von 0,99 auf. Die Analyse ergab, dass der Kortex, die Medulla und der Thalamus die idealen ZNS-Portionen für den Einsatz bei der RABV-Erkennung waren, basierend auf der Beobachtung, dass diese Strukturen die höchsten RABV-Werte besaßen. Die Testspezifität betrug 100%. Alle Proben waren positiv, es wurden keine fehlpositiven Ergebnisse festgestellt. Diese Methode kann verwendet werden, um RABV in Proben zu erkennen, die während der Diagnose von BPR niedrige RABV-Spiegel enthalten.

Die DFA-Ergebnisse zeigten 100%, 100%, 83,3%, 66% und 50% Positivität für RABV im Kortex, Thalamus, Medulla, Pons und Horn. Diese Ergebnisse bestätigten die vorherigen Ergebnisse, und mindestens drei der strukturen, die von jedem Gehirn seziert wurden, waren positiv für RABV. Eine repräsentative positive DAF-Färbung ist in Abbildung 1dargestellt.
Abbildung 2 zeigt die Verstärkung eines Fragments des RABV N-Gens (Schritt 5.5) mi...

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Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Dieses Protokoll stellt einen qRT-PCR-basierten Ansatz zur Bestimmung der Virus-Nukleoprotein (N)-Genkopienummer innerhalb verschiedener anatomischer Rinderhirnstrukturen unter Verwendung von In-vitro-Transkription dar.

Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen. Mexiko ist ein Land mit erheblichem Viehpotenzial. Die Staaten mit der höchsten Viehproduktion enthalten sowohl feuchte tropische Regionen als auch trockene Regionen, die durch das Vorhandensein der Vampirfledermaus Desmodus rotundus, dem Hauptsender der Tollwut, für Tollwutausbrüche gefährdet sind.Der Nachweis des Tollwutvirus Nukleoprotein N-Gen wird vor allem für die Tollwutdiagnose durch molekulare Tests verwendet. Mit PCR-basierten Ansätzen können minimale Mengen eines infektiösen Erregers in einer klinischen Probe durch die selektive und sich wiederholende Amplifikation einer DNA-Nukleotidsequenz nachgewiesen werden. qRT-PCR basiert auf der Detektion und Quantifizierung eines Moleküls, bei dem die Fluoreszenzsignalerhöhungen in direktem Verhältnis zur Menge des PCR-Produkts in einer einzigen Reaktion stehen.Mit zunehmender Anzahl von Kopien des Nukleinsäureziels steigt auch die Fluoreszenz. Auf dieser Grundlage bestand das Ziel der Studie darin, die quantitative qRT-PCR zu verwenden, um die Anzahl der virusfreien Partikel in verschiedenen anatomischen Strukturen von Rinderhirnen nach dem Tod aufgrund einer Tollwutinfektion zu bestimmen. Total RNA wurde direkt aus Rinderhirnen mit einer organischen Extraktionsmethode nach dem folgenden Protokoll extrahiert.Verwenden Sie 100 Milligramm Hirngewebe aus jeder anatomischen Struktur, um die gesamte RNA mit einem kommerziell erhältlichen Reagenz zu extrahieren, das Guanidiniumisothiocyanat enthält. Manuelle Homogenisierung von insgesamt 100 Milligramm Gewebe aus jeder Struktur in einem Milliliter des Guanidinium isothiocyanatreage reageimmittel durch Wirbeln mit einem Dounce Homogenisat mit einem kleinen Stößel im Mikrorohr für 15 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit. Die Proben fünf Minuten lang auf Eis bebrüten und dann 200 Mikroliter Chloroform hinzufügen.Mischen Sie die Proben 15 Sekunden lang kräftig. Zwei bis drei Minuten auf Eis bebrüten und dann bei 12 000 x g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die wässrige Phase auf ein sauberes Rohr übertragen und 500 Mikroliter Isopropylalkohol hinzufügen.Inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten bei 21 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den wässrigen Überstand durch Pipettieren.Die isolierte RNA wird als Pellet in der Röhre vorhanden sein. Als nächstes waschen Sie das RNA-Pellet mit einem Milliliter 75%Ethanol durch Pipettieren und Zentrifugieren bei 7, 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet bei Raumtemperatur um 21 Grad Celsius.Anschließend das Pellet in 50 Mikroliter nukleasefreiem Wasser verdünnen. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und -Qualität mit einem Spektralphotometer bei 260 Nanometern. In-vitro-Transkription erzeugt mRNA eines Zielgens.Verwenden Sie ein Primer-Paar, das das gesamte RABV N-Gen verstärkt, und eines, das als positiv für den qRT-PCR-Assay verwendet wird. Diese Primer wurden entwickelt, um das gesamte RABV N-Gen zu verstärken und einen Promotor hinzuzufügen, der die T7-Polymerase erkennt. Um das gesamte N-Gen RABV zu verstärken, verwenden Sie die Primer trans und RAB vorwärts und rückwärts und ein HIGH-Fidelity-PCR-Kit.Bereiten Sie für jede Reaktion einen PCR-Master-Mix vor, indem Sie einen sauberen PCR-Rohrreaktionspuffer mit 10 Mikromolaren pro Primer und 0,5 Einheiten Hochtreuepolymerase hinzufügen. Um das PCR-Produkt als Vorlage für die In-vitro-Synthese zu verwenden und Komponenten der enzymatischen Reaktion zu entfernen, reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem säulenbasierten Konzentrator-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Und dann mit einem Spektralphotometer quantifizieren.Für die RNA-Synthese verwenden Sie ein In-vitro-Transkriptionskit mit folgendem Reaktionsgemisch: fünf Mikroliter T7-Transkription 5X Puffer, 1,9 Mikroliter jedes Triphosphat-Nukleotids, 10 Mikrogramm gereinigte RABV-N-DNA und 2,5 Mikroliter des Enzymgemisches. Als nächstes, inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für vier Stunden. Dann fügen Sie einen Mikroliter von einer Einheit pro Mikrogramm Rnase-Freie DNase in das Reaktionsgemisch und inkubieren für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, um DNA-Kontamination zu beseitigen.Reinigen Sie die in vitro transkribierte RNA und konzentrieren Sie sie dann mit Phenol:Chlorform:Isoamylalkohol im Verhältnis 25:24:1. Setzen Sie das gereinigte RNA-Pellet in 70 Mikroliter TE-Puffer aus, und lagern Sie es dann bei 80 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Wiederholen Sie das PCR-Protokoll, bis etwa fünf Mikrogramm PCR-Produkt erhalten sind.Nach der Reinigung und Konzentration wird das in vitro transkribierte N-Gen mRNA in einer Konzentration von 4,711 Mikrogramm pro Mikroliter vorhanden sein. Bestätigen Sie, dass die in vitro transkribierte mRNA dem N-Gen nach Schritt 5 dieses Protokolls entspricht, und verwenden Sie diese als positive Kontrolle für die Echtzeit-Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion, qRT-PCR. Für die Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion verwenden Sie ein In-vitro-mRNA-Transkript bei der Codierung des gesamten N-Gens als positive Kontrolle.Zusammen mit einem kommerziellen einstufigen qRT-PCR-Kit, mit Hybridisierungssonden nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie die Sonde in Primern, die von Coronado und Kollegen 2010 beschrieben wurden, um eine konservierte Region des RABV unter Verwendung der folgenden thermischen Radfahrbedingungen zu erkennen. Führen Sie serielle Verdünnungen der in vitro transkribierten mRNA durch seriellepipetierung eines Mikrogramms pro Mikroliter mRNA in Die röhrchende Röhren durch, bis sechs entkoppelte Verdünnungen erhalten sind.Bereiten Sie Rohre mit einem Volumen von 100 Mikrolitern in dreifacher Ausfertigung für die Erstellung der Standardkurve vor. Führen Sie qRT-PCR wie zuvor beschrieben aus. Führen Sie qRT-PCR in einem thermischen Cycler mit einem Rotor durch, indem Sie die verschiedenen Gehirnproben gleichzeitig mit den laufenden Reaktionen verarbeiten, um eine Standardkurve zu erstellen und positive Steuerungen, Negativkontrollen und überzählige Stoffe zu verwenden, die aus der Zellkultur isoliert sind.Um die Nachweisgrenze, die Testwirksamkeit und die Empfindlichkeit des Tests zu bewerten, verwenden Sie eine Standardkurve in Dreifacharbeit unter den gleichen Bedingungen. Verwenden Sie für den Nachweis des RABV-Gens N die RNA aus Feldproben, Positivkontrollen, Negativkontrollen und Zellkulturübersprechern, um qRT-PCR mit dem zuvor beschriebenen PCR-Kit durchzuführen. Um die Anzahl der Kopien des RABV-Genoms in den Rinderhirnproben zu bestimmen, erhalten Sie CT-Daten aus der Standardkurve und biologischen Proben und aus jenen, die aus der Kalibrierkurvengleichung interpoliert sind. Diese Abbildung zeigt Rinderhirngewebe mit positiver Färbung gemäß der direkten Immunfluoreszenz.Die Ergebnisse zeigen 100%100%83,3%66% und 50% Positivität für RABV in der Kortex, Thalamus, Medulla, Pons und Horn jeweils. Diese Ergebnisse bestätigen die vorherigen Ergebnisse, und mindestens drei der Strukturen, die von jedem Gehirn seziert wurden, waren positiv für RABV. Andererseits zeigt die Gleichung der Standardkurve den Zusammenhang zwischen der Menge des RABV-Gengehalts in der Probe und der Größe des PCR-verstärkten Fragments.Die Menge des RABV-Gengehalts in Nanogrammen wurde durch Interpolation der CT-Werte in der Kalibrierkurve unter Verwendung der in dieser Abbildung dargestellten Gleichung abgeleitet. Mit dieser Gleichung wurde festgestellt, dass die Nachweisgrenze von einem mal 10 bis fünf Mikrogramm pro Mikroliter viraler RNA 36 Kopien des RABV-Genoms entspricht. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Test empfindlich ist und verwendet werden kann, um das Virus in Proben zu erkennen, die eine geringe Anzahl von Kopien des RABV N-Gens enthalten.Der Wirkungsgrad des Assays wurde anhand der Steigung der Standardkurve berechnet, die 3,28 betrug. Die für qRT-PCR verwendeten Proben zeigten eine Amplifikation des RABV N-Gens. Um die Anzahl der vorhandenen viralen Kopien zu bestimmen, wurden die CT-Werte für jede Probe mit der Kalibrierungskurvengleichung interpoliert.Die in Nanogrammen erzielten Ergebnisse wurden in die hier beschriebene Formel substituiert. Diese Tabelle zeigt die Vergleichsergebnisse zwischen qRT-PCR und DFA. Die Ergebnisse der qRT-PCR-Assays stimmten mit denen über ein DFA überein.Nach den Ergebnissen des qRT-PCR-Tests in den Fällen C und D ist der Thalamus die Struktur, die die höchste Anzahl von Kopien des RABV N-Gens besitzt. Dies deutet darauf hin, dass eine frühe Infektion von hypothalamischen und thalamischen Neuronen wichtig für die Entwicklung der Krankheit ist, da diese Neuronen die vegetativen Funktionen eines Tieres kontrollieren. Die Kopiennummern des RABV N-Gens, die in jeder Struktur jeder Probe nachgewiesen wurden, sind: die Empfindlichkeit und Spezifität des qRT-PCR-Tests sind wir beide zu 100%, da alle Proben positiv waren.Dieses Ergebnis stimmt mit den ersten Diagnosen der Proben überein. qRT-PCR ist eine hochempfindliche Technik. Einige der Schritte sind entscheidend, um die besten Ergebnisse zu erzielen.Eine davon ist die richtige Handhabung von Proben für die RNA-Extraktion. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da die RNA leicht abgebaut werden kann und die Ergebnisse daher beeinflusst werden könnten. Erwägen Sie, die Probe unter kalten Bedingungen zu halten, etwa vier Grad Celsius während des Prozesses.Berücksichtigen Sie außerdem, dass mehrere Runden pcR-Anwendung durchgeführt werden, wie in der In-vitro-Transkription erwähnt. Der in dieser Studie durchgeführte qRT-PCR-Assay konnte nur 36,3 Kopien des RABV N-Gens pro Milligramm Gewebe erkennen. Zu den am besten geeigneten Hirnstrukturen für qRT-PCR gehörten der Kortex und der Thalamus.Dies basiert auf den Beobachtungen, dass in diesen Strukturen höhere Konzentrationen des RABV-N-Gens nachgewiesen wurden und dass sie auch mit dem RABV-Referenztest positiv waren. Der Test konnte sehr niedrige Konzentrationen, 0,00023 mal 10 bis die neunten Kopien des Virus in verschiedenen Proben zu erkennen. Neben der Quantifizierung der Viruspartikel in der Probe scheint der Test ein gutes alternatives Diagnose- und Forschungswerkzeug für die Erkennung von RABV zu sein, das hier vorgestellt wird.

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