Name: detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients
Uploaded: 2020-09-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke medlemmene av Laboratory of Cancer Genomics and Biocomputing of Complex Diseases for deres ivrige observasjonsinnspill og deres deltakelse i flere diskusjoner på ulike stadier av dette prosjektet. Finansieringsstøtten inkluderer Israel Cancer Association (ICA-stipend for M.F-M 2017-2019) og Kamin-stipend fra Israel Innovation Authority (for M.F-M.).

Før blodinnsamling er det nødvendig med informert samtykke fra personer som deltar i forskningen og må innhentes. Forskningen beskrevet i dette manuskriptet ble utført i samsvar med Rabin Medical Center, Israel etikk komité (etikk kode: 0039-17-RMC) og Det medisinske fakultet Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Tyskland etikk komité (etikk kode: D 405/14).
1. Blodprøveinnsamling og lagring i cfDNA eller cfRNA konserveringsmiddelrør
<ol><li>Merk bevaringsrørene riktig</li>
...

Innsamlingen av pasientens blod i et rør, forsendelse og lagring er avgjørende første skritt i flytende biopsi. Feil håndtering kan svekke kvaliteten på plasmaet og derfor kan forstyrre resultatene av den flytende biopsien47. Hvis en blodprøve samles inn i et EDTA-blodrør, må plasmaet separeres innen to timer etter blodinnsamling for å unngå lysis av WBCer og frigjøring av genomisk DNA i plasma48. WbCs kan også gjennomgå apoptose i et EDTA-rør hvis det holdes ...

Teknologiske fremskritt har ført til sekvensering av hundrevis av kreftgenomer og transkripsjoner1. Dette har bidratt til å forstå landskap av molekylære endringer på tvers av ulike krefttyper2. Videre studier på disse landskapene har bidratt til å karakterisere sekvensielle somatiske endringer og gengenfusjoner3 som er involvert i kreft eller tumorprogresjon, ved å forstyrre apoptoseveier4. Derfor kan somatiske mutasjoner og gengenfusjoner gi informasjon om svulster ved å tjene som biomarkører hos individuelle pasienter for en bestemt tumortype5, identifisere eksisterende primære svulster prognose6, kategorisere sekundære svulster basert påmolekylære endringer 7, og identifisere druggable tumor mål8. Slik informasjon kan legge til rette for å velge personlig behandling for kreftpasienter og ved fastsettelse av positive og negative behandlingsresponser9. Imidlertid er det å skaffe tumormateriale for å identifisere genomisk profilering av tumorvev en invasiv prosedyre10. Videre består en tumorbiopsi bare en liten del av en heterogen svulst; og kan derfor ikke være representativ for den molekylære profilen til hele svulsten11. Seriell overvåking og tumorgenomtyping krever en gjentatt samling av tumorvev, som vanligvis ikke er mulig på grunn av invasiviteten av tumorbiopsiprosedyre og sikkerhetsproblemene som oppstår fra slike prosedyrer12.
Den flytende biopsiteknikken, derimot, har fått enorm oppmerksomhet i presisjononkologi det siste tiåret13,14. Det skyldes hovedsakelig ikke-invasivitet av denne teknikken, og muligheten for at den gjentas på flere tidspunkter, og dermed muliggjør en brukervennlig og sikker overvåkingsteknikk for sykdomskursene15,16. Flytende biopsi er basert på et fenomen som tumorceller multipliserer raskt, og samtidig gjennomgår mange av dem apoptose og nekrose. Dette fører til frigjøring av apoptotisk celleavfall i pasientens blod, sammen med DNA-fragmentene som kuttes i nøyaktige størrelser under apoptose17. Apoptose av ikke-kreftceller fører også til frigjøring av cellulære rusk i blodet, men apoptosehastigheten i disse cellene er relativt mye lavere enn tumorceller18. Rasjonaliteten av den flytende biopsiteknikken er å fange tumorrelaterte molekyler som DNA, RNA, proteiner og tumorceller14,19 som sirkulerer kontinuerlig i blodet. Uliketeknikker 20 kan brukes til analyse av disse molekylene, inkludert neste generasjons sekvensering (NGS), digital dråpepolymerasekjedereaksjon (ddPCR), sanntids PCR og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Flytende biopsi teknikk gjør det mulig å identifisere biomarkører som er kjennetegn på tumorceller. Disse biomarkørmolekylene frigjøres ikke bare fra bestemte deler av en svulst, men heller fra alle deler av svulsten21. Derfor representerer markører identifisert i flytende biopsi molekylær profilering av en hel heterogen svulst, i tillegg til andre svulster i kroppen, og dermed har fordeler over vevbiopsibasert teknikk22.
CfDNA har en kort halveringstid i det sirkulerende blodet fra noen få minutter til 1-2 timer23. Den korte halveringstiden til cfDNA forenkler imidlertid sanntidsanalyser ved å evaluere behandlingsrespons og dynamiske tumorvurderinger. Tumoravledede cfDNA-nivåer indikerer prognostisering av tumorstadium/størrelse som fremgår av flere studier, som viste en sammenheng mellom cfDNA-nivåer og overlevelsesresultatene24. Videre har studier vist at cfDNA har en bedre prediksjonskapasitet enn eksisterende tumormarkører25. Prognosen for cfDNA er enda mer uttalt etter kreftbehandling, høyere nivåer av cfDNA etter behandling korrelerer godt med redusert overlevelsesrate og motstand mot behandling. Mens lavere nivåer av cfDNA etter behandling generelt tilsvarer positiv behandlingsrespons. I tillegg forenkler cfDNA tidlig påvisning av behandlingsrespons enn de tradisjonelle deteksjonsmetodene.
CfDNA øker muligheten for tidlig påvisning av kreftrelaterte mutasjoner: under tidlig stadium sykdom15, utbruddet av symptomer26 og før kreftdiagnose opptil 2 år27. Som cfDNA frigjøres fra flere tumorregioner eller foci, gir analysen et omfattende syn på tumorgenomet det representerer28. Derfor gjør cfDNA det mulig å oppdage somatiske mutasjoner som kan ha blitt savnet i vevsprøvene29. Som intra-tumor heterogenitet og subklonale mutasjoner kan oppdages ved dyp sekvensering av genomiske regioner som strekker seg over tusenvis av baser, derav analysen av cfDNA gjør det mulig å avdekke spesifikke molekylære undertyper med distinkte genomiskesignaturer 13. For å få et lignende nivå av informasjon gjennom vevsprøve mange faste biopsier ville ha vært nødvendig.
Videre viste cfDNA-nivåene hos pasienter med en lokalisert sykdom som tykktarm, eggstokk og lungekreft etter kirurgisk behandling og/ eller kjemoterapi, å være en kraftig prognostisk markør for tilbakefall av kreft og behandlingsutfall20. Videre, hos pasienter med tykktarms-, bryst- og lungekreft, kan analyser av cfDNA fra blodet med hell oppdage de tumorspesifikke endringene, noe som førte til den nøyaktige forutsigelsen av tilbakefall flere måneder i forveien13. Videre, behandlingsresistensmarkører, slik som KRAS mutasjoner hos pasienter med CRC mottar anti-EGFR terapi30; VAFs for gener som PIK3CA, MED1 eller EGFR hos pasienter med brystkreft etter behandling med ulike behandlinger31; og EGFR T790M resistensmutasjon hos lungekreftpasienter behandlet med EGFR-målrettede TKIer32 kan også identifiseres ved cfDNA-analyse.
Oppsummert kan cfDNA-analysen brukes til å identifisere nøyaktige biomarkører innen onkologi13,33. I denne protokollen ble blodprøver av 3 gliompasienter og 3 friske kontroller behandlet for å oppnå genomisk DNA fra WBCer og cfDNA fra plasmaet. I gliomakreft fungerer mutasjoner i IDH, TERT, ATRX, EGFR og TP53 som en diagnostisk samt prognostiske markører som kan hjelpe til med tidlig diagnose av gliomasvulster, klassifisere ulike typer gliomasvulster, veilede nøyaktig behandling for den enkelte pasient og forstå behandlingsresponsen34,35. Mutasjonsstatus for disse genene kan identifiseres ved hjelp av blodavledet cfDNA. I dette manuskriptet presenterer vi en detaljert protokoll av plasma-avledet cfDNA som har blitt brukt til å studere mutasjonsendringer i gliomakreft12. Slike cfDNA-baserte flytende biopsiprotokoll forklart i denne artikkelen kan brukes til å studere mutasjonsendringer i mange andre typer kreftformer. Videre har en nylig studie vist at cfDNA-basert flytende biopsi kan oppdage 50 forskjellige typer kreft36.
Blodprøveinnsamling, lagring og forsendelse er avgjørende trinn i denne protokollen, da ukontrollert temperatur under disse trinnene forårsaker lysis av WBCer, noe som fører til frigjøring av genomisk DNA fra WBC inn i plasmaet og forårsaker forurensning av cfDNA-prøven, noe som påvirker resten av prosedyren37. Hemolyse på grunn av ukontrollert temperatur kan svekke nedstrøms prøveforberedelsesprosesser av cfDNA, for eksempel PCR trinn38. Serumet inneholder en høy andel av germline cfDNA i stedet for plasma, selv om det presenterer en stor bakgrunnsstøy for tumor-assosiert cfDNA39. Derfor, for å isolere tumor-assosiert cfDNA, plasma er en passende prøve39. Blod som trekkes i et antikoagulant som inneholder blodoppsamlingsrør, bør sentrifugeres umiddelbart eller innen opptil to timer, for å skille plasmaet og for å unngå cfDNA-kontaminering. I denne protokollen brukes dedikerte kommersielle cfDNA bevaring blodinnsamlingsrør (se Materialse tabell), som er et alternativ til antikoagulant som inneholder blodinnsamlingsrør. Disse dedikerte blodinnsamlingsrørene bevarer cfDNA og cfRNA, og forhindrer lysis av WBCer i opptil 30 dager ved omgivelsestemperatur, og opptil 8 dager ved 37 °C. Dette forenkler opprettholdelse av riktig temperatur under en blodprøve forsendelse og til plasma og WBC er skilt40.
Det finnes tre typer cfDNA utvinning metoder tilgjengelig: faseisolasjon, silisium-membran basert spin kolonne, og magnetisk perle-basert isolasjon41. Den silisiummembranbaserte spin-kolonnemetoden ga en høy mengde cfDNA med høy integritet sammenlignet med andre cfDNA-ekstraksjonsmetoder42.
Den kvantitative evalueringen av DNA er et grunnleggende krav i flytende biopsi, det er behov for å utvikle en enkel, rimelig og standardisert prosedyre for enkel implementering og bred bruk. Tre vanlige metoder for cfDNA-kvantifisering er spektrofotometriske, fluoriske og qPCR. Den fluorometriske metoden er bevist bedre over de andre metodene om nøyaktighet, kostnad og enkel ledning43.
Integriteten og renheten til cfDNA kan estimeres ved enten agarose elektroforese eller kapillær elektroforese. Agarose elektroforese viser verken følsomhet ved lav konsentrasjon av cfDNA eller har høy oppløsning for å vise nøyaktig fragmentstørrelse av cfDNA. På den annen side har kapillær elektroforese en fordel over agarose elektroforesen ved å overvinne de tilknyttede utfordringene og derfor mye brukt av forskerne for cfDNA fragmentstørrelsesanalyse. I denne protokollen ble fragmentstørrelsesfordelingen av isolert cfDNA estimert ved hjelp av et automatisert kapillærelektroforeseinstrument (se Materials tabell).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Clip for Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5042-1398</td>
			<td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td>
			<td>Norgen Biotek Corp.</td>
			<td>63950</td>
			<td>Norgen&#39;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&#8212; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Cleaner Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for Gel Matrix</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>185-5990</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Basic Chip Vortex</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>MS-3-S36</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740952.5</td>
			<td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells 
			(e.g., bacteria), and many other sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac Connecting System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19419</td>
			<td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>84010</td>
			<td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (96&#8211;100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block or similar at 56 &#176;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (adjustable)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

Identifisering av mutasjoner i svulster hos kreftpasienter er et svært viktig skritt i sykdomsbehandling. Disse mutasjonene tjener som biomarkører for tumordiagnose, så vel som for behandlingsvalget og dens respons hos kreftpasienter. Den nåværende gullstandardmetoden for å oppdage tumormutasjoner innebærer en genetisk test av tumor-DNA ved hjelp av tumorbiopsier. Imidlertid er denne invasive metoden vanskelig å bli utført gjentatte ganger som en oppfølgingstest av tumormutasjonsrepertoaret. Flytende biopsi er en ny og fremvoksende teknikk for å oppdage tumormutasjoner som en brukervennlig og ikke-invasiv biopsitilnærming.
Kreftceller multipliserer raskt. Parallelt gjennomgår mange kreftceller apoptose. Rusk fra disse cellene slippes ut i pasientens sirkulasjonssystem, sammen med fint fragmenterte DNA-stykker, kalt cellefrie DNA -fragmenter (cfDNA), som bærer tumor-DNA-mutasjoner. Derfor, for å identifisere cfDNA-baserte biomarkører ved hjelp av flytende biopsiteknikk, samles blodprøver fra kreftpasientene, etterfulgt av separasjon av plasma og buffy pels. Deretter behandles plasma for isolering av cfDNA, og den respektive buffy pelsen behandles for isolering av pasientens genomiske DNA. Begge nukleinsyreprøvene kontrolleres deretter for deres kvantitet og kvalitet; og analysert for mutasjoner ved hjelp av neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS).
I dette manuskriptet presenterer vi en detaljert protokoll for flytende biopsi, inkludert blodinnsamling, plasma og buffy coat separasjon, cfDNA og germline DNA ekstraksjon, kvantifisering av cfDNA eller germline DNA, og cfDNA fragment berikelse analyse.

Separasjon av plasma 8,5-9 ml blod samlet i cfDNA eller cfRNA konserveringsmiddelrør gir rundt ~ 4 ml plasma i volum. Volumet av plasma atskilt fra blod samlet i EDTA-rør kan variere avhengig av temperaturen. Eksponering av EDTA-rør som inneholder blod ved en temperatur høyere enn 37 °C fører til redusert plasmavolumutbytte44.
Fluoranalyse Resultater cfDNA konsentrasjon i 1 ml plasma av hver av glioma pasienter #1 og #3 og f...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

I dette papiret presenterer vi en detaljert protokoll for ikke-invasiv flytende biopsiteknikk, inkludert blodinnsamling, plasma- og buffycoatseparasjon, cfDNA og germline DNA-ekstraksjon, kvantifisering av cfDNA eller germline DNA, og cfDNA fragmentberikelsesanalyse.

Påvisning av cellefritt DNA i blodplasmaprøver av kreftpasienter

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Liquid biopsy using cell-free DNA may identify tumor mutations and fusions to potentially diagnose the tumor type and its drug response. In contrast to tissue biopsy, cell-free DNA based liquid biopsy offers a non-invasive approach that can be performed multiple times to monitor cancer disease progression. To isolate circulating cell-free DNA from a patient plasma sample, add 100 microliters of Proteinase K and 800 microliters of lysis buffer supplemented with one microgram of carrier RNA to one milliliter of patient plasma.Thoroughly pulse vortex the solution for 30 seconds before incubating for 30 minutes at 60 degrees Celsius. At the end of the incubation, add 1.8 milliliters of binding buffer to the tube and thoroughly mix with 15 to 30 seconds of pulse vortexing. After a five minute incubation on ice, insert a silica membrane column into a vacuum apparatus connected to a vacuum pump and firmly insert a 20 milliliter tube extender into the open column to prevent sample leakage.At the end of the incubation, carefully pour the mixture into the tube extender and switch on the vacuum pump. When all of the lysate has completely run through the columns, switch off the vacuum pump, release the pressure to zero millibars and carefully discard the tube extender without contaminating the adjacent columns. Transfer the column into a collection tube for centrifugation to remove any residual lysate.After discarding the flow-through, add 600 microliters of wash buffer 1 to the column for a second centrifugation. After discarding the flow-through, centrifuge the column again with 750 microliters of wash buffer 2. After discarding the flow-through, add 750 microliters of 96 to 100%ethanol to the column for an additional centrifugation.Transfer the column into a new two milliliter collection tube for another centrifugation before placing the membrane column assembly into a new two milliliter collection tube at 56 degrees Celsius for 10 minutes. At the end of the incubation, transfer the column into a new 1.5 milliliter elution tube and add 50 microliters of elution buffer to the column for a three minute incubation at room temperature. Then, centrifuge the recovered solution for one minute at 20, 000 times G to elute the nucleic acids.To analyze the size of the DNA fragments, first secure the base plate to the chip priming station and adjust the clip at the lowest position. Place a new high sensitivity DNA chip onto the chip priming station and add nine microliters of gel dye mix to the bottom of the G chip well. Position the plunger at one milliliter and close the chip priming station.Close the lock of the latch until it clicks, set the timer to 60 seconds, and press down the plunger until it is held by the clip. After exactly 60 seconds, use the clip release mechanism to release the plunger. When the plunger retreats to at least the 300 microliter mark, wait for five seconds before slowly retracting the plunger to the one milliliter position.Open the chip priming station to remove nine microliters of the gel dye mix and transfer the gel to the bottom of the high sensitivity DNA chip G well. To load the DNA marker, dispense five microliters of DNA marker into the ladder well and to the 11 sample wells. To load the ladder and samples, add one microliter of the DNA ladder to the DNA ladder well, one microliter of sample to the used sample wells and one microliter of marker to the unused sample wells.Place the high sensitivity DNA chip horizontally in the adapter for 60 seconds of vortexing at 2, 400 revolutions per minute, taking care that the bulge that fixes the high sensitivity DNA chip is not damaged. After vortexing, confirm that the electrode cartridge is properly inserted and that the chip selector is positioned to double stranded high sensitivity DNA. Carefully mount the high sensitivity DNA chip into the receptacle and confirm that the electrode cartridge is fit exactly into the wells of the chip before closing the lid.The fragment analyzer software screen will display a chip icon to indicate that the chip has been inserted and the lid has been closed. To initiate the analysis, open the assay menu and select the double stranded DNA high sensitivity assay. Enter the sample names into the table and click start to initiate the chip run.At the end of the run, immediately remove and discard the chip according to good laboratory practice. Here are the expected cell-free DNA bioanalyzer graph from a representative glioma patient in which cell-free DNA fragments are enriched at 166 base pairs and there is no genomic DNA contamination in the sample can be observed. Here, the same fragment enrichment graph can be observed after next generation sequencing library preparation of the cell-free DNA.Note the fragment enrichment shift from 166 to 291 base pairs due to the attachment of 125 base pair indexes and adapters. For this second representative patient, a very slight enrichment of the cell-free DNA fragments can be observed. Despite the low cell-free DNA concentration, the addition of next generation sequencing adapters to the cell-free DNA and PCR amplification leads to a visible cell-free DNA library peak on the fragment enrichment graph, indicating that the library was prepared successfully from this low concentration cell-free DNA sample.For this third representative patient, the cell-free DNA fragments peaked near 166 base pairs, but genomic DNA contamination was also apparent near the 10, 380 base pair reference ladder peak. Plasma sample lysis is a crucial step in this protocol, as incomplete lysis will affect the cell-free DNA yield and the entire downstream process.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Cell-Free DNA Integrity Analysis i Urinprøver

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Plasmaprøver kopiere nummer Detection bruke sanntid PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Med 22C 3 Anti-PD-L1 antistoff konsentrere seg om biopsi og cytologi eksempler fra ikke-småcellet lungekreft pasienter

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Metoder for å vurdere rollen c-Fos og Dusp1 i Oncogene avhengighet

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Påvisning av en sirkulerende MicroRNA tilpasset Panel hos pasienter med metastatisk tykktarmskreft

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Evaluering av kolorektal kreftrisiko og prevalens ved deteksjon av avføring DNA-integritet

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Påvisning og overvåking av tumor assosiert sirkulerende DNA i pasient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Enkel og rask rullende sirkelforsterkningsbasert påvisning av topoisomerase 1-aktivitet i biologiske råvarer

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...

Diagnose av vitreoretinal lymfom ved bruk av cellefritt DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Forfatter Spotlight: Fremme VRL-diagnose ved bruk av cellefri DNA-ekstraksjon fra glassaktig humor 

Cellefri DNA-ekstraksjon av glassaktige og vandige humorprøver for diagnostisering og overvåking av vitreoretinalt lymfom

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...