Name: injection of hydrogel biomaterial scaffolds to the brain after stroke
Uploaded: 2020-10-01T13:00:00
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Nos gusta reconocer a los Institutos Nacionales de Salud y al Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares por su financiación (R01NS079691).

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con IUCAC en la Universidad de Duke y la Universidad de California en Los Ángeles. En este estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6J de 8 a 12 semanas de edad. Los animales fueron alojados a temperatura controlada (22 ± 2 °C), con un período de ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso a alimentos granulados y agua ad libitum. Los protocolos de analgesia y sedación se describen como aprobados por el IUCAC, pero pueden diferir de los protocolos utilizados en otros labo...

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	<li>National Center for Health Statistics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , (2016).</li><li>Benjamin, E. 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T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duel-function+injectable+angiogenic+biomaterial+for+the+repair+of+brain+tissue+following+stroke.">Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke.</a> Nature Materials. 17, 642-651 (2018).</li><li>Cook, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-delivered+brain-derived+neurotrophic+factor+promotes+tissue+repair+and+recovery+after+stroke.">Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).</li><li>Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. 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Aquí demostramos un modelo de accidente cerebrovascular permanente fácilmente reproducible, mínimamente invasivo y describimos cómo inyectar un biomaterial en el infarto cinco días después del accidente cerebrovascular. El uso del tinte fototrombótico Rose Bengal y un láser colimado de 520 nm conectado al dispositivo estereotáxico nos da la capacidad de posicionar el trazo en la corteza motora del ratón con mayor precisión. Cinco días después del accidente cerebrovascular, la ubicación del infarto es visibl...

El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad y la quinta causa principal de muerte en los Estados Unidos1. Aproximadamente el 87% de todos los accidentes cerebrovasculares son isquémicos, mientras que la mayoría del 13% restante son hemorrágicos2. Un accidente cerebrovascular isquémico se define como el bloqueo del flujo sanguíneo en una arteria al tejido circundante. Esta oclusión resulta en la privación de oxígeno y la necrosis posterior que a menudo conduce a la discapacidad permanente en los pacientes sobrevivientes. Si bien ha habido una disminución en la tasa de mortalidad del accidente cerebrovascular3,se espera que su prevalencia aumente a 3,4 millones de personas para 20304. Este aumento en los sobrevivientes discapacitados y la consiguiente carga económica ha llevado a un impulso para la investigación del accidente cerebrovascular que se centra en los mecanismos de reparación neuronal. Después del accidente cerebrovascular hay un período inflamatorio que conduce a la formación de una cicatriz que impide que la región necrótica se expanda. La región que rodea el núcleo necrótico se denomina "peri-infarto" y hay una fuerte evidencia de que la plasticidad en esta región, que incluye el aumento de la angiogénesis, la neurogénesis y la brotación axonal, está directamente relacionada con la recuperación observada en modelos animales y humanos5. Dado que no hay modelos in vitro que puedan replicar adecuadamente las interacciones complejas después del accidente cerebrovascular, los modelos animales son esenciales para la investigación del accidente cerebrovascular.
Hay varios modelos in vivo que se pueden utilizar para producir accidente cerebrovascular isquémico. Uno de los modelos más comunes utilizados en ratones es la oclusión de la arteria cerebral media, o MCAo, a través de la oclusión distal o proximal (a través del filamento intraarterial). El modelo proximal, también conocido como filamento MCAo (fMCAo), generalmente resulta en grandes accidentes cerebrovasculares isquémicos que abarcan entre el 5% y el 50% del hemisferio cerebral, dependiendo del número de factores6. En estos modelos, una sutura o filamento se avanza desde la arteria carótida interna hasta la base de la arteria cerebral media (MCA) y se mantiene en su lugar durante un período de tiempo específico. Este método de oclusión, que puede hacerse temporal o permanente, produce un infarto que se centra en el cuerpo estriado y puede o no implicar la corteza suprayacente6. El tamaño del accidente cerebrovascular resultante es muy variable, y se requieren técnicas de imagen, como el doppler láser, para confirmar la efectividad del procedimiento en cada ratón. La oclusión del filamento intraarterial o intraluminal que dura más de 30 minutos produce accidentes cerebrovasculares en el extremo más grande del rango de tamaño. Algunos investigadores se han centrado en tiempos de oclusión de filamentos más cortos, que requieren un enfoque experimental sustancial y validación de laboratorio7. Los modelos de MCAo de filamento en ratones siguen etapas similares de muerte celular, progresión isquémica y formación de una región periinfarto como se ve en los casos de accidente cerebrovascular humano; sin embargo, los accidentes cerebrovasculares más grandes se parecen más al estado de enfermedad de los infartos cerebrales malignos, que son menos comunes, menos tratables accidentes cerebrovasculares humanos6. Mientras tanto, la oclusión distal de MCA requiere una cirugía y una craniectomía más involucradas. En este modelo, la parte distal del MCA que corre a lo largo de la superficie del cerebro se ocluye directamente con una atadura de sutura o cauterización. En algunas variaciones de la técnica, las arterias carótidas se ocluyen unilateral o transitoriamente-bilateralmente. Un beneficio del MCAo distal es que produce un trazo basado en cortical que es menos variable en tamaño que el modelo de filamento. Sin embargo, el modelo distal produce una producción conductual más pobre debido a la transección de la arteria carótida externa (ECA), que también es una preocupación con fMCAo6.
Un modelo alternativo de accidente cerebrovascular que es conocido por ser menos invasivo es el modelo fototrombótico (PT). El modelo de PT da como resultado una localización bien definida de la isquemia y se asocia con una alta tasa de supervivencia8. La técnica se basa en un tinte fotosensible inyectado por vía intraperitoneal que permite la fotooxidación intravascular simplemente irradiando el tejido deseado con una luz o láser9. Tras la excitación, se forman radicales de oxígeno que causan daño endotelial, lo que activa la agregación plaquetaria y la formación de coágulos en el área irradiada8,9. El estricto control sobre el tamaño y la ubicación del trazo, así como la alta reproducibilidad del modelo PT, lo hacen ideal para estudiar biomateriales. Si bien la precisión es posible utilizando un láser y coordenadas estereotáxicas, hay algunas desventajas que pueden hacer que este modelo sea menos ideal para pocos estudios. A diferencia del modelo fMCAo, el modelo de carrera PT no se puede volver a perfundir. Por lo tanto, los materiales para investigar los agentes neuroprotectores específicos de los daños después de la reperfusión o los mecanismos posteriores a la reperfusión no serían útiles aquí8. Además, debido al insulto microvascular del modelo PT, se observa penumbra isquémica relativamente pequeña. En cambio, se produce edema vasogénico local, que no es característico del accidente cerebrovascular humano, lo que hace que este modelo sea indeseable para los estudios farmacológicos preclínicos centrados en el área del periinfarto6,8.
El objetivo general de las estrategias de biomateriales en el accidente cerebrovascular es administrar agentes bioactivos o actuar como una matriz extracelular sustituta para el crecimiento del tejido cerebral. Una estrategia que exploraremos utilizando nuestros métodos es administrar hidrogel directamente en el núcleo del accidente cerebrovascular, a diferencia del tejido periinfarto donde se administran muchas terapias celulares actuales10. La justificación de este enfoque es que la entrega en el tejido necrótico que se encuentra en el núcleo evitará interrumpir el tejido sano circundante o en recuperación. Suponemos que la difusión de cualquier agente activo incluido dentro del biomaterial podrá alcanzar el peri-infarto desde el núcleo, especialmente porque encontramos que la entrega de biomateriales de hidrogel reduce el grosor de la cicatriz glial11. Esto es importante ya que se ha demostrado que la región periinfarto exhibe neuroplasticidad después del accidente cerebrovascular, lo que la convierte en un objetivo atractivo. Además, la entrega de una matriz sustituta al núcleo del accidente cerebrovascular se puede cargar con12 factores angiogénicos o13 neurogénicos para guiar la formación de tejido nuevo, así como células para el parto14. La entrega celular se mejora en gran medida mediante el uso de una matriz porque protege a las células de las fuerzas de inyección severas y el entorno local presente durante la entrega, así como fomenta la diferenciación y el injerto15.
Estos biomateriales terapéuticos inyectables tienen relevancia clínica en aplicaciones de accidente cerebrovascular, ya que actualmente no existen terapias médicas que estimulen la recuperación neuronal después del accidente cerebrovascular. Los circuitos neuronales subyacentes involucrados en la recuperación se encuentran en el tejido cerebral que está adyacente al núcleo del accidente cerebrovascular16,mientras que el núcleo del accidente cerebrovascular en sí está desprovisto de tejido neural viable. Anticipamos que la entrega de un biomaterial en el núcleo del accidente cerebrovascular necrótico tiene el potencial de estimular el tejido adyacente hacia procesos regenerativos a través de una serie de mecanismos mencionados anteriormente, incluida la liberación de factores de crecimiento de depósito13,la estimulación del crecimiento del tejido y la promoción del desarrollo del tejido cerebral en recuperación11,12, la alteración de las respuestas inmunes17y la entrega de terapias derivadas de células madre14, 18. Sin embargo, para estudiar eficazmente la posibilidad de estas aplicaciones, se necesita un método consistente y reproducible para inducir el accidente cerebrovascular e inyectar biomateriales. El modelo de trazo PT utiliza técnicas que ofrecen un control preciso sobre la orientación y la ubicación del trazo. Un láser conectado al dispositivo estereotáxico guía las orientaciones, y las bombas conectadas a los dispositivos estereotáxicos controlan la velocidad de inyección del material sin la necesidad de formas adicionales de imágenes. Por lo tanto, hemos optado por describir los métodos para realizar un accidente cerebrovascular PT en las cortezas motoras de ratones y para inyectar biomateriales en el núcleo del accidente cerebrovascular. Aquí, utilizamos hidrogeles de partículas recocidas microporosas (MAP) como biomaterial para inyección sin células añadidas ni factores de crecimiento. Además, explicamos cómo recuperar con éxito el cerebro con biomaterial intacto, y discutimos los ensayos de inmunoquímica utilizados para analizar el resultado del accidente cerebrovascular con y sin inyección de biomateriales.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-028</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS090735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>14824663</td>
			<td>Syringes used to inject biomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25uL Positive displacement pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Beam Expander, 400-650nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GBE02-A</td>
			<td>Laser beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Stage Platform</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 Antibody, goat</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab5076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12&#34;</td>
			<td>Medsupply</td>
			<td>367294</td>
			<td>For perfusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BKF12- Matte Black Aluminum Foil</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BKF12</td>
			<td>To cover anything that is reflective when using laser.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2&#34;</td>
			<td>Sklar surgical instruments</td>
			<td>64-2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8-12 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Assembly Rob</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER3-P4</td>
			<td>3&#34; Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>For creating burr hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM1.01036.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Controller for pigtailed lasers</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CLD1010LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89031-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP 25 pipette tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F148012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG H&#38;L (488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-rabbit IgG H&#38;L (647)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-rat IgG H&#38;L (555)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS DPX Mountant</td>
			<td>Elecron Microscopy Sciences</td>
			<td>13512</td>
			<td>Mounting solution for slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16564</td>
			<td>For gelatin coating slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Paraformaldehyde, Granular</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-162</td>
			<td>For making 45 PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESD Worstation kit</td>
			<td>Elmstat</td>
			<td>WSKK5324SB</td>
			<td>Need for setting up the laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Bench Wall Plate, unthreaded</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HCA3</td>
			<td>Need for connecting laser to Kopf shaft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiberPort</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PAF-X-5-A</td>
			<td>FC/APC&#38; APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP Antibody, rat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Plate</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>HP-4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>For staining slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Prep Pads</td>
			<td>Medx Supple</td>
			<td>MED MDS093917H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jewlers Forceps #5</td>
			<td>GFS chemicals</td>
			<td>46085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Safety Glasses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG10B</td>
			<td>Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck</td>
			<td>United Scope</td>
			<td>LED-11C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical USP Grade Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade</td>
			<td>Intefra Miltex</td>
			<td>V96-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer</td>
			<td>Harvard aparatus</td>
			<td>72-6110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-pump variable flow</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>70730-064</td>
			<td>Pump for perfusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RBMA-200c</td>
			<td>For TTC slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Gas Anethesia Head Holder</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanojet Control Box</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>10050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanojet pump header</td>
			<td>Chemxy</td>
			<td>10051</td>
			<td>Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>NC9459562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-rupture ear bars 60&#186;</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062 338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LP520-MF100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charge glass slides</td>
			<td>Hareta</td>
			<td>AHS90-WH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power engergy meter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Used to measure your mW laser output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dr. Foster Smith</td>
			<td>9N-76855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal Probe Mouse</td>
			<td>kopf Instruments</td>
			<td>Ret-3-ISO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal Dye 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330000-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2&#34; depth</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>1770-02</td>
			<td>For connecting laser to sterotaxic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim photodiode power sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130VC</td>
			<td>Used with power energy meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35&#34; thick 2 Retaining</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP02</td>
			<td>For connecting laser expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10002-726</td>
			<td>To inject rose bengal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StainTray Slide Staining System</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920-2</td>
			<td>For staining slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterotaxic device</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>940</td>
			<td>Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps -1x2 teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps - straight/broad Shanks</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upper Bracket Clamp</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>1770-c</td>
			<td>For connecting laser to sterotaxic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhessive 3mL</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-361931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogue Professional My Manicurist</td>
			<td>Bargin Source</td>
			<td>6400</td>
			<td>For Burrs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Bead Sterilizers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75999-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>For tissue embeding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of hydrogel biomaterial scaffolds to the brain after stroke

El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad y la quinta causa principal de muerte en los Estados Unidos. Aproximadamente el 87% de todos los accidentes cerebrovasculares son accidentes cerebrovasculares isquémicos y se definen como el bloqueo repentino de un vaso que suministra sangre al cerebro. A los pocos minutos de la obstrucción, las células comienzan a morir y resultan en daños irreparables en los tejidos. Los tratamientos terapéuticos actuales se centran en la eliminación de coágulos o lisis para permitir la reperfusión y prevenir daños cerebrales más graves. Aunque la plasticidad cerebral transitoria puede salvar parte del tejido dañado con el tiempo, fracciones significativas de pacientes quedan con déficits neurológicos que nunca se resolverán. Existe una falta de opciones terapéuticas para tratar los déficits neurológicos causados por el accidente cerebrovascular, lo que enfatiza la necesidad de desarrollar nuevas estrategias para tratar a esta creciente población de pacientes. Los biomateriales inyectables se están diseñando actualmente para mejorar la plasticidad cerebral y mejorar la reparación endógena a través de la administración de agentes activos o células madre. Un método para probar estos enfoques es utilizar un modelo de accidente cerebrovascular de roedor, inyectar el biomaterial en el núcleo del accidente cerebrovascular y evaluar la reparación. Conocer la ubicación precisa del núcleo del accidente cerebrovascular es imperativo para el tratamiento preciso después del accidente cerebrovascular, por lo tanto, es preferible un modelo de accidente cerebrovascular que resulte en una ubicación predecible del accidente cerebrovascular para evitar la necesidad de imágenes antes de la inyección. El siguiente protocolo cubrirá cómo inducir un accidente cerebrovascular fototrombótico, cómo inyectar un hidrogel de manera controlada y precisa, y cómo extraer y crioseccionar el cerebro mientras se mantiene intacto el biomaterial. Además, destacaremos cómo estos mismos materiales de hidrogel se pueden utilizar para la co-entrega de células madre. Este protocolo se puede generalizar al uso de otros biomateriales inyectables en el núcleo del accidente cerebrovascular.

El objetivo de este método era demostrar cómo inyectar biomateriales en el cerebro después de un accidente cerebrovascular. Se utilizó un modelo fototrombótico con rosa de bengala y un láser de 520 nm para la orientación controlada de la lesión del accidente cerebrovascular tanto en tamaño como en ubicación. Cinco días después del accidente cerebrovascular, el infarto se pudo visualizar durante la cirugía(Figura 1B)y mediante TTC e imágenes de diapositivas teñidas de IHC<stron...

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Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke

El accidente cerebrovascular es un problema global con opciones de tratamiento mínimas y sin terapia clínica actual para regenerar el tejido cerebral perdido. Aquí describimos métodos para crear un accidente cerebrovascular fototrombótico preciso en la corteza motora de roedores y la posterior inyección de biomateriales de hidrogel para estudiar sus efectos sobre la regeneración de tejidos después del accidente cerebrovascular.

Inyección de andamios de biomaterial de hidrogel en el cerebro después de un accidente cerebrovascular

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes ...

The reproducible injection of hydrogel scaffolds into a rodent ischemic stroke model allows for the study of how materials and other deliver therapeutics affect brain repair, regeneration and behavioral improvement. The main advantages of using the photothrombotic stroke model to study brain material interactions are the reproducible location and size. Which allow injection of materials into the stroke core without imaging.The photothrombotic stroke model is designed to be a relevant model for ischemic stroke, in a region of the brain, the motor cortex, that is commonly affected by stroke in humans. And to provide a relevant behavioral readout for stroke, which is motor control of the limb. So as to evaluate a candidate therapeutic, like a biopolymer hydrogel.Confirm a lack of response to toe pinch in an anesthetized mouse. Then weigh the mouse to determine how much Rose bengal dye to inject, and secure it to a stereotaxic device equipped with a laser. After shaving and disinfecting the surgical area, use forceps to tent the skin between the ears and eyes, and insert a blade into the raised skin to make a lateral one to two centimeter midline incision in the skin.Separate the skin and press the forceps lightly onto the parietal bones to locate the bregma. Use a surgical marker to label the bregma with a dot. And wearing laser safety goggles, move the laser over the skull of the mouse, fixing the stereotaxic device at a 90 degree angle.Select the 10 milli watt preset and turn on the laser. Adjust to the X and Y axis until the laser is directly over the bregma. Reset the X and Y on the digital display console, and move the laser 1.8 millimeters left of the bregma.Bring the laser as close to the skull as possible without letting the laser touch the skull. When the laser is in position, turn it off and use a disposable 29 gauge needle to intra peritoneally inject the appropriate volume of Rose bengal dye. Immediately start a timer to allow the dye to circulate systemically for seven minutes.While the dye is circulating, select the preset for 40 milliwatts without turning on the laser. When the timer goes off, turn on the laser and set the timer for 13 minutes. When the timer goes off again, change the laser back to 10 milliwatts.Mark this spot with the surgical marker and turn off the laser. Lift the laser and unlock it from the 90 degree angle, so it can be moved away from the mouse. Use cotton to apply sterile saline to the surgical area as necessary, and drill at the mark in small bursts, perpendicular to the surface of the skull.Place a small wipe next to the mouse and use the forceps to pull the skin close together and upward. Dab any large drops of surgical glue at the end of the tip on the wipe, and despairingly apply surgical glue to the skin. Hold skin together with forceps for 10 seconds, then continue to apply glue until no additional openings are visible in the skin.For hydro gel injection into the stroke region, attach injection pumps to the stereotaxic device. Then set the flow rate to one microliter per minute and volume to the desired injection amount in microliters. Reopen the incision over the brain, and use saline soaked cotton to clean any debris from the skull.A white, yellow circle of tissue, and the burr hole from the drill will be visible. Lock the injection pump at 90 degrees over the mouse. Clean the glass syringe with sterile saline.And remove the needle. Use a 25 microliter positive displacement pipette to back load the syringe with 10 microliters of hydrogel, and use the plunger to push the gel all the way to the front of the syringe. Reassemble the syringe.And continue pushing until the gel visibly exudes from the needle. Load the syringe onto the pump, and move the pump and the X and Y directions to orient the syringe over the burr hole. Move the pump in the Z direction until the needle touches the top of the hole.And reset the Z on the digital display console. Move the syringe 0.75 millimeters in the Z direction and press start on the pump console to inject four to six microliters of the hydrogel at a one microliter per minute flow rate. When all of the hydro gel has been delivered, set a five minute timer to allow the gel to begin cross-linking.After five minutes, turn the Z knob to slowly pull up the syringe. When the needle is far enough away from the skull, unlock and remove the pump. Then close the skin over the skull, and place the mouse in a clean cage with monitoring until it has recovered from the anesthesia.At the appropriate experimental end point, use blunt thin forceps to carefully remove pieces of the skull to expose the brain. Using small surgical scissors to cut away the bone over the stroke site as necessary. After harvesting, place the brain in 10 to 15 milliliters of 4%para formaldehyde overnight for 16 to 24 hours, before placing the tissue into 30%sucrose.The brain will be ready for cryo section when it sinks to the bottom of the tube. Five days after a stroke induction, the infarct can be visualized during surgery and by TTC and immunohistochemically stained slides imaging. An increase in the laser diameter with a two X lens leads to a visual increase in stroke lesion that spans over 2.5 millimeters versus a single one millimeter section using the laser only.Hyaluronic acid based hydrogel microparticle injection into the stroke lesion five days after a stroke, results in the formation of micro and annealed particles with a porous scaffold that facilitates cell migration into the stroke core. The tissue that are as scaffolds can be retrieved and used for molecular cellular or tissue level analysis. So it's a single cell RNA-seq.Flow cytometry or clarity. Also behavioral analysis can be performed to assess behavioral improvement. This approach delivers a candidate therapeutic, a biopolymer hydrogel, into the stroke cavity.Which is a potential cavity in stroke. An area of dead tissue that can accept a transplant. Additionally, this cavity is adjacent to the area of the brain that undergoes the most plasticity after stroke, the peri infarct tissue.So a candidate therapeutic like a biopolymer hydrogel can deliver cells or small molecules to the part of the brain that is really the target for recovery and stroke.

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Investigación

Biología

Intravitreous Injection for Establishing Ocular Diseases Model

Inyección intravítrea para el establecimiento de modelos Enfermedades Oculares

Intravitreous injection is a widely used technique in visual sciences research. It can be used to establish animal models with ocular diseases or as ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Microfabricación de chip del tamaño de andamios para el cultivo de células en tres dimensiones

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Cerebro del pez cebra ventrículo inyección

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

La puerta de enlace para el cerebro: la disección de los ojos de Primates

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Mapeo de las secuelas de la theta ráfaga de estimulación sobre la corteza auditiva humana con imágenes funcionales

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola de la rata

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...