Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

وقد دعم هذه الدراسة من قبل الصندوق المفتوح من مختبر الدولة الرئيسية للتكنولوجيا الحيوية الصيدلانية، جامعة نان جينغ، الصين (منحة لا. KF-GN-201905)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنح 81971501). وليام J. ليو هو مدعوم من قبل برنامج العلماء الشباب ممتازة من NSFC (81822040) وبكين خطة نجمة جديدة للعلوم والتكنولوجيا (Z181100006218080).

1. إعداد التعبير يبني
<ol><li>استرداد تسلسل الجينات MHC الفئة الأولى (بما في ذلك الجينات المتوقعة) من الخفافيش من قاعدة بيانات NCBI.</li>
	<li>استرجاع أعلى الثدييات MHC الأول تسلسل سلسلة الثقيلة من قاعدة بيانات متعددة الأشكال المناعية (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) وقاعدة بيانات UniProt (www.uniprot.org).</li>
	<li>للحصول على مجمع?...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

بناء مجمع البروتين الهجين من خلال استبدال heterologous من مختلف التاشيا هي استراتيجية مشتركة للتحقيقات الوظيفية والهيكلية عندما لا تتوفر مجمع متماثل، كما هو الحال في MHC الأول ويغاندس. غير أن الملخصات المتعلقة بالمنهجية والتكنولوجيا محدودة. هنا، تم تحليل هيكل الخفافيش MHC الأول، Ptal-N * 01:01، استقرت...

يوجد مجمع التحلل (MHC) الرئيسي في جميع الفقاريات وهو مجموعة من الجينات التي تحدد المناعة التي تتوسطها الخلايا لمسببات الأمراض المعدية. MHC الفئة الأول يعرض الببتيدات الذاتية، مثل المكونات الفيروسية المنتجة على عدوى الفيروس، لمستقبلات الخلايا T (TCR) على سطح CD8+ الخلايا T للتوسط مناعة الخلوية والمشاركة في تنظيم المناعة1. توفر دراسة هيكلية من MHC I ملزمة الببتيدات معلومات حول الزخارف ملزمة الببتيد وميزات العرض من قبل جزيئات MHC الأول، الذي يلعب أدوارا حيوية في تقييم الاستجابات المناعية CD8+ T الخلية وتطوير اللقاحات.
منذ التبلور الأول والتصميم الهيكلي للجزيئية MHC I بواسطة Bjorkman et al.2، عزز تحليل البنية البلورية لجزيئات MHC I بشكل كبير فهم كيفية ربط الببتيدات بجزيئات MHC I ، ويساعد على فهم تفاعل السلاسل الخفيفة مع السلاسل الثقيلة والببتيدات. وأشارت سلسلة من الدراسات المتابعة أنه على الرغم من أن الجينات ترميز سلسلة الضوء لا يرتبط مع MHC، سلسلة الضوء هو بروتين رئيسي لتجميع جزيئات MHC الأول3،4. يتفاعل مع المجالات الثلاثة من جزيئات الفئة MHC I على أسطح متعددة. عندما تكون سلسلة الضوء غائبة، لا يمكن التعبير عن جزيئات MHC من الفئة I بشكل صحيح على سطح الخلايا التي تقدم المستضد ولا يمكن أن تتفاعل مع TCR لممارسة وظائفها المناعية.
MHC الأول يتكون من سلسلة ثقيلة (سلسلة H) وسلسلة خفيفة (أي β2-ميكروغلوبولين (β2م))، ويتم تجميعها من خلال ربط لببتيد مناسب5. يتكون الجزء خارج الخلية من سلسلة H من مجالات α1 وα2 وα36. تشكل مجالات α1 وα2 الأخدود ملزم الببتيد (PBG). سلسلة β2متر بمثابة وحدة فرعية هيكلية من مجمع التجميع في MHC I، استقرار التشكل من المجمع، وهو مرافق الجزيئية ل MHC I H سلسلة قابلة للطي7،8،9. وقد أظهرت سلسلة من الدراسات أن سلاسل MHC I H من الثدييات المختلفة مثل الخفافيش (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10، ريسوس المكاك (الرئيسيات) (مامو - ب * 17)11 (مامو - A * 01)12 (مامو - A * 02)13، فأر (القوارض) (H - 2Kد)14،1 15, (Carnivora) (DLA-88*50801)16, ماشية (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 وequine (بيريس 25- يمكن الجمع بين18 و 18 مع β2م(الجدول 1)(Eqca-N*00602) (Eqca-N*00601). وغالبا ما تستخدم هذه الجزيئات الهجينة في الدراسات الهيكلية والوظيفية. ومع ذلك، لم يتم تلخيص منهجية الدراسة الوظيفية والهيكلية للمهجن الهجين MHC I مع β2م. وفي الوقت نفسه، لا يزال الأساس الهيكلي للتبادل β2متر بين مختلف أنواع الـ 2 من نوع "تاكسا" غير واضح.
هنا ، ويرد ملخصا للإجراءات للتعبير MHC الأول ، والمجلدات ، والتبلور ، وجمع البيانات الكريستال وتحديد الهيكل. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحليل بدائل محتملة β2متر من الأنواع المختلفة من خلال مقارنة التشكل الهيكلي لل MHC I استقرت من قبل β2م المتجانية المتجانسة. هذه الأساليب سوف تكون مفيدة لمزيد من MHC I الدراسة الهيكلية وC8+ T تقييم الاستجابة المناعية خلية في السرطان والأمراض المعدية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

يلعب مجمع التحلل الرئيسي (MHC) دورًا محوريًا في عرض ببتيد المستضد والاستجابات المناعية للخلايا التائية ضد الأمراض المعدية وتطور الورم. الهجين MHC I معقدة مع β2-ميكروغلوبولين (β2م) يمكن أن تستقر في المختبر. هذا هو وسيلة مجدية لدراسة MHC I من الثدييات، عندما β homologous2متر غير متوفر. وفي الوقت نفسه، يشار إلى أن الثدييات βاستبدال 2م لا يؤثر بشكل كبير على عرض الببتيد. ومع ذلك، هناك ملخص محدود فيما يتعلق بالمنهجية والتكنولوجيا ل MHC الهجين I معقدة مع β2-microglobulin (β2م). هنا، يتم عرض طرق لتقييم جدوى استبدال β2م في دراسة MHC الأول. وتشمل هذه الأساليب إعداد بنيات التعبير؛ (أ) تنقية هيئات الإدماج وإعادة تجمّع مجمع MHC؛ تحديد حرارة البروتين. الكريستال الفحص وتحديد الهيكل. تقدم هذه الدراسة توصية لفهم وظيفة وهيكل MHC I ، وهي مهمة أيضًا لتقييم استجابة الخلايا التائية أثناء الأمراض المعدية والعلاج المناعي للورم.

وذكرت الأعمال السابقة أن HeV-المستمدة من HeV1 (DFANTFLP) الببتيد قدمتها Ptal-N * 01:0110,19. هنا، القدرة ملزمة من هذا الببتيد إلى Ptal-N *01:01 مع الخفافيش المتجانسة β2متر (bβ<font face="Helv...

Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

يصف البروتوكول الطرق التجريبية للحصول على مستقر مجمع الهيستوتكية الرئيسية (MHC) الفئة الأولى من خلال β المحتملة2-ميكروغلوبولين (β2م) استبدالات من أنواع مختلفة. دراسة المقارنة الهيكلية من MHC I استقرت بواسطة homologous و heterologousβ 2م تم التحقيق.

استقرار وهيكل من الخفافيش الهيستوكومباينية الرئيسية مجمع الفئة الأولى مع heterologous β2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

في هذه الدراسة، استخدمنا الخفافيش MHC الفئة الأولى كنموذج لتلخيص المنهجية، وتقييم جدوى من فئة MHC الهجين أنا معقدة مع بيتا-2 مصغّر غير مغاير. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن استبدال الثدييات B2M لا يؤثر بشكل كبير على عرض الببتيد. في الواقع، فإن فئة MHC الهجينة يمكنني تفعيل بنية مماثلة وظيفة للجزيء الأصلي.يمكن استخدام هذه التقنيات لتسهيل الدراسة الوظيفية والمهيكلة لـ MHC I لتقييم استجابة الأنسجة أثناء الأمراض المعدية والعلاج المناعي للورم. لE.coli التحول الثقافة إضافة 10 نانوغرام من plasmid التي تحتوي على الخفافيش أو الإنسان MHC الفئة الأولى بيتا اثنين من سلسلة الهيدروجين microglobulin إلى 100 ميكرولترات من تعليق تعادل والاستحمام تعليق في الجليد لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، والحرارة البكتيريا لمدة 90 ثانية في 42 درجة مئوية، والعودة إلى الثقافة حمام الجليد لمدة دقيقتين.بعد ذلك إضافة 800 ميكرولتر من مرق lysogeny إلى الثقافة، وهز التعليق على منصة هزاز لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، و 200 التناوب في الدقيقة الواحدة. في نهاية الحضانة، انتشار 100 ميكرولترات من البكتيريا على شفرة الثقافة المضادة للمضادات الحيوية المناسبة المقاومة. في صباح اليوم التالي، واختيار استنساخ واحد البكتيرية تحولت مؤخرا وتطعيم استنساخ مع ثلاثة ملليلتر من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة.ضع الثقافة على منصة هزاز في 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. في صباح اليوم التالي، نقل 500 ميكرولترات من المخزون البكتيري المنشط إلى 50 ملليلتر من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة، وإعادة البكتيريا إلى حاضنة هزاز بين عشية وضحاها. تقسيم المخزون البكتيري المنشط المتبقية إلى 500 ميكرولتر aliquots وإضافة كل aliquot إلى 500 ميكرولتر وحدات التخزين من 40 ٪ الجلسرين ، للتخزين ناقص 80 درجة مئوية.لتوليد كميات كبيرة من البروتين المؤتلف، في صباح اليوم التالي نقل التعليق البكتيري إلى لترين من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة بنسبة واحد إلى 100، وإعادة الثقافة إلى حاضنة هزاز حتى يتم تحقيق امتصاص 0.6 في 600 نانومتر. ثم، إضافة واحد ملليمتر IPTG إلى الثقافة للحث على التعبير عن الجينات عبر. بعد أربع إلى ست ساعات من الحث، ونقل الثقافة البكتيرية إلى زجاجات للطرد المركزي، وإعادة تعليق الكريات الخلية البكتيرية في 60 ملليلتر من برنامج تلفزيوني للزجاجة الواحدة.ثم تحرير البروتين المؤتلف أعرب عن طريق تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية 99 مرات، لمدة ست ثوان وفاصل زمني من 12 ثانية في 300 واط لكل سونيكيشن. لاحتواء الجسم تنقية جمع البكتيريا سونيكاتيد عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في حجم مناسب من الغسيل العازلة لاثنين من الطرد المركزي إضافية. بعد الغسيل الثاني، إعادة تعليق الهيئات إدراج وإعادة تعليق العازلة، وتوضع جانبا 20 ميكرولتر aliquot من العينة لصفحة SDS لاختبار نقاء الجسم إدراج.الطرد المركزي العينة المتبقية، وتزن هيئة إدراج تحتوي على بيليه. إضافة العازلة حل إلى الكريات إلى تركيز النهائي من 30 ملليغرام من الجسم إدراج لكل ملليلتر من العازلة. واستخدام stirrer المغناطيسي لتحريك ببطء الحل في أربع درجات مئوية، حتى يتم حل الهيئات إدراج في العازلة حل.بعد التخلص من الرواسب، وتخزين الهيئات إدراج في ناقص 20 أو ناقص 80 درجة مئوية. لإعادة التكتّن بمركب MHC، أضف 5 ملليمولار مُخفض الجلوتاثيون و0.5 مللُر تأكسد الجلوتاثيون في 250 إلى 300 ملليلتر، وهو عازل إعادة رقعة من أربع درجات مئوية. وتحريك ببطء الحل على مُحرك مغناطيسي عند أربع درجات مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة.لسلسلة الهيدروجين MHC وبيتا اثنين من تخفيف ميكروغلوبولين، تحميل الجسم إدراج في حقنة ملليلتر واحد وحقن كامل حجم ملليلتر من محلول الجسم إدراج في لتر واحد من المخزن المؤقت refolding بالقرب من شريط اثارة، للحصول على تخفيف سريع وفعال. بعد ذلك ، قم بحل خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من الببتيد في كبريتيد ثنائي الميثيل ، وسرعة حقن 200 ميكرولتر من الببتيد في محلول إعادة الطييف كما هو موضح للتو. بعد 10 إلى 20 دقيقة من التحريك البطيء ، حقن ثلاثة ملليلتر من أجسام إدراج سلسلة H في حجم لتر واحد جديد من عازلة إعادة الطييف والسماح لإعادة التحريك للمضي قدما في أربع درجات مئوية لمدة ثماني إلى 10 ساعات.لتحديد تركيز البروتين الذي أعيد طيه يضاف مخزن التبادل إلى غرفة مضغوطة مع غشاء أوكسيداز متعدد النحاس 10 كيلودالتون، وتركيز المخزن المؤقت إلى 30 إلى 50 ملليلتر. نقل حل إعادة التكديس إلى أنبوب الطرد المركزي، وإزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي. نقل بعناية supernate إلى الغرفة وزيادة تركيز العازلة إلى حجم النهائي من ما يقرب من ملليلتر واحد.إزالة أي الملوثات النهائية عن طريق الطرد المركزي ونقل السوبر إلى أنبوب معقمة. استخدام عشر مائة GL حجم العمود استبعاد لتنقية البروتينات ، وجمع العينات في الذروة ، وتحليلها باستخدام صفحة SDS. جمع قمة مجمع MHC وتركيز البروتين إلى تركيز نهائي من 15 ملليغرام لكل ملليلتر.ثم تخفيف المجمع إلى 7.5 ملليغرام لكل ملليلتر التركيز. لأداء تبلور MHC المعقدة والببتيد باستخدام تقنية نشر بخار قطرة الجلوس ، أضف 0.8 ميكرولترات من العينة إلى لوحة بلورية تجارية وختم اللوحة. اِثُل محلول العينة ضد 100 ميكرولترات من محلول الخزان عند أربع أو 18 درجة مئوية، واستخدم المجهر لمراقبة نمو البلورات بانتظام على مدى الأشهر الستة القادمة.لحماية المبردة، في نهاية التجربة، ونقل بلورات إلى محلول تخزين يحتوي على 20٪ الجلسرين قبل تبريد العينات بسرعة في تيار النيتروجين الغازي 100 درجة كلفن. ثم جمع بيانات الحيود بالأشعة السينية وفقا للبروتوكولات القياسية. لتحديد هيكل المجمعات الكريستالية، افتح بيانات الحيود الهيكلي عالية الدقة في برنامج Denzo ضمن حزمة برامج HK L 2000، واختر نموذجًا أوليًا في بنك بيانات البروتين.لتحديد بنية البروتين، افتح البيانات في برنامج "فير MR" في CCP4، واستخدم نموذج الأشعة السينية المكررة لصقل المفصل الأولي. ثم استخدم فينيكس صقل وحدها ووضع مشترك للأشعة السينية وحدها صقل، والنيوترون المشترك لصقل الأشعة السينية. بعد كل جولة من الصقل، تحقق يدويا النموذج ضد Fo-Fc، و 2Fo-Fc خرائط الكثافة النووية الإيجابية في كوت.في هذه التجارب التمثيلية، تم تقييم القدرات الملزمة لفيروس هيندرا Hendra فيروس واحد الببتيد إلى الخفافيش MHC فئة I سلاسل الهيدروجين مع الخفافيش المتجانسة بيتا اثنين من ميكروغلوبولين وبيتا الإنسان heterologous اثنين microglobulin. في كلا التحليلين، تشكلت بلورات ذات دقة عالية من خلال الرناتون مع سلسلة الضوء الجزئية بيتا اثنين. في غياب بيتا اثنين من الغلوبولين، وهذه المجمعات لا تشكل.في الفئة MHC I سلسلة الهيدروجين Hendra فيروس واحد، الإنسان بيتا اثنين من هيكل microglobulin، والمخلفات المحفوظة H31، D53، W60، وY63 من بيتا الإنسان اثنين من الغلوبولين، والتي تتوافق مع الخفافيش بيتا اثنين من ميكروغلوبولين، جعل الاتصال مع الجزء السفلي من الأخدود ربط الببتيد والحفاظ Q8، Y10، R12، و 24 بقايا، والتي تتوافق مع اثنين من بيتا microglobulinس ملزمة إلى المجال الثلاثة ألفا. في الخفافيش العامة والهياكل البشرية، متوسط الجذر المتوسط مشتق مربع من المخلفات واحد إلى 184 من سلاسل الهيدروجين هو 0.248 تحت كل من الكربون ألفا ذرة تراكب، مما يدل على أنه لا توجد اختلافات بين هذين المجمعين. هيكل محاذاة الببتيد يظهر أن تأكيدات Hendra فيروس واحد الببتيدات في هذين المجمعين متشابهة تماما.تسلسل المحاذاة يظهر أيضا أن الأحماض الأمينية من بيتا اثنين من الغلوبولين من أنواع مختلفة يتم الحفاظ عليها بشكل كبير. من المهم أن نقدم للمجمعات المعادية بكفاءة عالية للإبلاغ. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لتحديد مناسبة بيتا اثنين من الجلوبيولين الصغيرة واستخدام هيئات إدراج تنقية للغاية.ويمكن استخدام هذا البروتوكول للحصول على مستقر MTC I المعقدة من خلال بيتا المحتملة اثنين من بدائل ميكروغلوبولين في الأنواع الأخرى، وإلى وجود هم MTC أنا هيكل ودالة. يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها من هذه الدراسات لتقييم استجابات الخلايا التائية أثناء الأمراض المعدية والأمراض المناعية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

الاستقراء والتقييم من فئة التوحد التبديل في تنقية خلايا الفئران B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

الميكروويف بمساعدة التشخيص السريع للأمراض النباتية من الفيروسات المجهر الإلكتروني ناقل

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

متعدد الاهداف نهج المعالجة المتوازية لتحديد الجينات إلى هيكل البلمرة الأنفلونزا PB2 الوحدة الفرعية

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

في الكشف الموضعي للخلايا CD4 T Autoreactive في الدماغ والقلب عن طريق التوافق النسيجي الرئيسية الدرجة الثانية مجمع Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

تطبيق اضطرابات متناسقة تشبه التدليك على عجول الماوس ومراقبة التغيرات الناتجة عن الضغط العضلي العضلي

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

تقييم التعبير عن الهستو التوافق الكبرى مجمع الفئة الأولى على الخلايا العصبية الأولية مورين فرس النهر عن طريق قياس التدفق الخلوي

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...