Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af den åbne fond af statens nøglelaboratorium for farmaceutisk bioteknologi, Nan-jing University, Kina (Grant no. KF-GN-201905), National Natural Science Foundation of China (tilskud 81971501). William J. Liu er støttet af Excellent Young Scientist Program af NSFC (81822040) og Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

1. Udarbejdelse af udtrykskonstruktioner
<ol><li>Hent sekvenserne af MHC klasse I-gener (herunder forudsagte gener) fra flagermus fra NCBI-databasen.</li>
	<li>Hent højere pattedyr MHC I tunge kædesekvenser fra Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) og UniProt-databasen (www.uniprot.org).</li>
	<li>For at opnå opløselige MHC-komplekser skal sekvenserne mutageniseres for at fjerne de cytosliniske og transmembrane-regioner.</li>
	<li>Klon generne kodning ectodomains af flagermus Ptal-N * 01:01 (Ge...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

Opførelsen af et hybridproteinkompleks gennem heterolog substitution fra forskellige taxaer er en fælles strategi for funktionelle og strukturelle undersøgelser, når det homologe kompleks ikke er tilgængeligt, som i MHC I og dets ligands. Der er dog begrænset opsummering af metoden og teknologien. Heri blev strukturen af bat MHC I, Ptal-N*01:01, stabiliseret af bβ2m eller hβ2m analyseret. De vigtigste aminosyrer på β2m bindende til Ptal-N*01:01 viste sig at være bevaret mellem ...

Det største histokompatibilitetskompleks (MHC) findes i alle hvirveldyr og er et sæt gener, der bestemmer den cellemedierede immunitet over for smitsomme patogener. MHC klasse I præsenterer endogene peptider, såsom virale komponenter produceret ved virusinfektion, til T-cellereceptorer (TCR) på overfladen af CD8+ T-celler for at mægle cellulær immunitet og deltage i immunregulering1. En strukturel undersøgelse af MHC I binding til peptider giver oplysninger om peptid bindende motiver og præsentation funktioner ved MHC I molekyler, som spiller afgørende roller i evalueringen af CD8+ T celle immunrespons og vaccine udvikling.
Siden den første krystallisering og strukturelle bestemmelse af MHC I molekylær af Bjorkman et al.2, krystalstrukturanalysen af MHC I-molekyler har i høj grad fremmet forståelsen af, hvordan peptider binder sig til MHC I-molekyler og hjælper med at forstå samspillet mellem lyskæder med tunge kæder og peptider. En række opfølgende undersøgelser viste, at selv om de gener, der koder lyskæden, ikke er forbundet med MHC, er lyskæden et nøgleprotein til samling af MHC I-molekyler3,4. Det interagerer med de tre domæner af MHC klasse I molekyler på flere overflader. Når lyskæden er fraværende, kan MHC klasse I molekyler ikke udtrykkes korrekt på overfladen af antigen-præsentere celler og kan ikke interagere med TCR til at udøve deres immunologiske funktioner.
MHC I består af en tung kæde (H-kæde) og lyskæde (dvs. β2-microglobulin (β2m)) og samles gennem binding til en passende peptid5. H-kædens ekstracellulære segment består af α1-, α2- og α3-domæner6. α1- og α2-domænerne danner peptidbindingsrillen (PBG). Den β 2 m kædefungerersom en strukturel underenhed af samlingskomplekset i MHC I, der stabiliserer kompleksets kropsbygning og er en molekylær chaperone til MHC I H-kædefoldning7,8,9. En række undersøgelser har vist, at MHC I H kæder fra forskellige pattedyr såsom flagermus (Chiroptera) (Ptal-N *01:01)10, rhesus makak (Primater) (Mam11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, hund (Carnivora) (DLA-88 *50801)16, kvæg (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 og heste (Peris (Eqca-N*00602 og Eqca-N*00601)18 kan kombineres med heterologe β2m (tabel 1). Disse hybridmolekyler bruges ofte i strukturelle og funktionelle undersøgelser. Metoden til den funktionelle og strukturelle undersøgelse af hybrid MHC I med heterolog β2m er imidlertid endnu ikke sammenfattet. I mellemtiden er det strukturelle grundlag for den udskiftede β2m mellem forskellige taxa fortsat uklart.
Heri opsummeres proceduren for MHC I-udtryk, refolding, krystallisering, krystal dataindsamling og strukturbestemmelse. Derudover analyseres potentielle substitutioner af β2m fra forskellige arter ved at sammenligne den strukturelle kropsbygning af MHC I stabiliseret af homologe og heterologe β2m. Disse metoder vil være nyttige for yderligere MHC I strukturelle undersøgelse og CD8+ T celle immunrespons evaluering i kræft og smitsomme sygdomme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

Den store histokompatibilitet kompleks (MHC) spiller en central rolle i antigen peptid præsentation og T celle immunrespons mod smitsomme sygdomme og tumor udvikling. Den hybride MHC I, der er sammensat med heterolog β 2-microglobulin (β2m) substitution fra forskellige arter, kan stabiliseres in vitro. Dette er et muligt middel til at undersøge pattedyrs MHC I, når den homologe β2m ikke er tilgængelig. I mellemtiden er det angivet, at pattedyr β2m substitution ikke påvirker peptidpræsentationen væsentligt. Der er dog begrænset opsummering med hensyn til metoden og teknologien til hybrid MHC I, der er kompleks med heterolog β 2-mikroglobulin (β2m). Heri præsenteres metoder til evaluering af gennemførligheden af heterologe β2m substitution i MHC I-undersøgelsen. Disse metoder omfatter udarbejdelse af udtrykskonstruktioner; rensning af inklusionsorganer og omdringning af MHC-komplekset bestemmelse af proteintermosterstabilitet krystalscreening og strukturbestemmelse. Denne undersøgelse giver en anbefaling til forståelse funktion og struktur AF MHC I, og er også signifikant for T celle respons evaluering under smitsomme sygdomme og tumor immunterapi.

Tidligere arbejde rapporterede, at HeV-afledte HeV1 (DFANTFLP) peptid blev præsenteret af Ptal-N * 01:0110,19. Heri blev bindingskapaciteten for denne peptid til Ptal-N*01:01 med homolog flagermus β2m (bβ2<font face="Helvetica...

Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Protokollen beskriver eksperimentelle metoder til at opnå stabile større histokompatibilitetskomplekser (MHC) klasse I gennempotentielleβ 2-mikroglobulin (β2m) substitutioner fra forskellige arter. Den strukturelle sammenligning af MHC I stabiliseret af homologe og heterologe β2m blev undersøgt.

Stabilitet og struktur Bat Major Histocompatibility Complex Klasse I med heterolog β2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

I denne undersøgelse brugte vi Bat MHC klasse I som model til at opsummere metoden og til at evaluere gennemførligheden af en hybrid MHC-klasse I, der er kompleks med heterolog beta-2 mikroglobulin. Tidligere undersøgelser har vist, at pattedyr B2M substitution ikke i væsentlig grad påvirker peptid præsentation. Faktisk kan hybrid MHC klasse I aktivere en lignende struktur og funktion til det oprindelige molekyle.Disse teknikker kan bruges til at lette den funktionelle og strukturerede undersøgelse af MHC I for vævsrespons evaluering under smitsomme sygdomme og tumor immunterapi. For E.coli kultur transformation tilføje 10 nanogram plasmid indeholder flagermus eller human MHC klasse I beta to mikroglobulin brint kæde til 100 mikroliter af udlignet suspension og bade suspensionen i is i 30 minutter. Ved afslutningen af inkubationen choker bakterierne i 90 sekunder ved 42 grader Celsius og returnerer kulturen til isbadet i to minutter.Derefter tilsættes 800 mikroliter lysogeny bouillon til kulturen, og ryst suspensionen på en gyngeplatform i 20 minutter ved 37 grader Celsius og 200 rotationer i minuttet. Ved afslutningen af inkubationen spredes 100 mikroliter af bakterierne på et passende antibiotikaresistent kulturblad. Den næste morgen skal du vælge en enkelt nyligt omdannet bakterieklon og vaccinere klonen med tre milliliter LB med antibiotisk medium.Placer kulturen på gyngeplatformen ved 37 grader Celsius i 12 til 16 timer. Næste morgen overføres 500 mikroliter af den aktiverede bakteriebestand til 50 milliliter LB med antibiotisk medium, og bakterierne returneres til den vuggende inkubator natten over. Opdel den resterende aktiverede bakteriebestand i 500 mikroliter aliquots og tilsæt hver aliquot til 500 mikroliter mængder på 40% glycerol, for minus 80 grader Celsius opbevaring.For at generere store mængder rekombinant protein overføres bakterieophænget næste morgen til to liter LB med antibiotisk medium ved et forhold på 1 til 100 og returnerer kulturen til den vuggende inkubator, indtil der opnås en absorbans på 0,6 ved 600 nanometer. Derefter tilsættes en millimolar IPTG til kulturen for at fremkalde ekspression af transgenet. Efter fire til seks timers induktion overføres bakteriekulturen til flasker til centrifugering, og bakteriecellepillerne suspenderes igen i 60 milliliter PBS pr. flaske.Frigør derefter det udtrykte rekombinante protein ved ultralydscelleforstyring 99 gange i seks sekunder og et interval på 12 sekunder ved 300 Watt pr. Sonication. Til optagelse af kropsrensning opsamles de sonikerede bakterier ved centrifugering, og pellets suspenderes igen i en passende mængde vaskebuffer til yderligere to centrifugeringer. Efter den anden vask, suspendere optagelse organer og re-suspension buffer, og der er afsat en 20 microliter aliquot af prøven for SDS side for at teste optagelse kroppen renhed.Centrifuge den resterende prøve og veje det indeslutningsorgan, der indeholder pellet. Der tilsættes opløsningsbuffer til pellets til en endelig koncentration på 30 milligram inklusionskrop pr. milliliter buffer. Og brug en magnetisk omrører til langsomt at røre opløsningen ved fire grader Celsius, indtil inklusionsorganerne opløses i opløsningsbufferen.Efter at have kasseret bundfaldet skal du opbevare inklusionsorganerne ved minus 20 eller minus 80 grader Celsius. For MHC kompleks refolding, tilføje en fem millimolar reduceret glutathion og 0,5 millimolar oxideret glutathion ved 250 til 300 milliliter, en fire grader Celsius refolding buffer. Og rør langsomt opløsningen på en magnetisk omrører ved fire grader Celsius i 10 til 20 minutter.For MHC hydrogenkæde og beta to mikroglobulin fortynding, indlæse optagelse kroppen i en en milliliter sprøjte og injicere hele en milliliter volumen optagelse kropsopløsning i en liter refolding buffer nær rørestangen, for at opnå en hurtig og effektiv fortynding. Derefter opløses fem milligram pr. milliliter peptid i dimethylsulfoxid, og der injiceres hurtigt 200 mikroliter peptid i refoldingsopløsningen, som det netop er påvist. Efter 10 til 20 minutters langsom omrøring injiceres tre milliliter H-kædeinddragelsesorganer i et nyt volumen på en liter refoldingsbuffer og lad refolding fortsætte ved fire grader Celsius i otte til 10 timer.For at bestemme den refolded proteinkoncentration tilsættes udvekslingsbuffer til et trykkammer med en 10 kilodalton multi kobberoxidasemembran og koncentrerer bufferen til 30 til 50 milliliter volumen. Refoldingsopløsningen overføres til et centrifugerør, og bundfaldet fjernes ved centrifugering. Overfør forsigtigt supernaten ind i kammeret, og koncentrer bufferen yderligere til et slutvolumen på ca. en milliliter.Fjern eventuelle endelige forurenende stoffer ved centrifugering, og overfør supernatet til et sterilt rør. Brug en ti tre hundrede GL størrelse udelukkelse kolonne til at rense proteiner, indsamle prøverne på toppen, og analysere dem ved hjælp af SDS side. Opsamle MHC komplekse peak og koncentrere proteinet til en endelig koncentration på 15 milligram per milliliter.Derefter fortyndes komplekset til 7,5 milligram pr. milliliterkoncentration. For at udføre krystallisering af den komplekse MHC og peptid ved hjælp af siddedråbediffusionsteknikken skal du tilføje 0,8 mikroliter af prøven til et kommercielt krystalbræt og forsegle brættet. Prøveopløsningen skal ligestilles med 100 mikroliter reservoiropløsning ved fire eller 18 grader Celsius og bruge et mikroskop til regelmæssigt at observere krystalvæksten i løbet af de næste seks måneder.For kryogen beskyttelse overfører krystallerne ved forsøgets afslutning til en opbevaringsopløsning, der indeholder 20% glycerol, før prøverne hurtigt afkøles i en 100 graders Kelvin gasformig nitrogenstrøm. Derefter indsamle x-ray diffraktion data i henhold til standard protokoller. For at bestemme strukturen af krystalkomplekserne skal du åbne de strukturelle røntgendiffraktionsdata i høj opløsning i Denzo-programmet i HK L 2000-softwarepakken og vælge en indledende model i proteindatabanken.For at bestemme proteinets struktur skal du åbne dataene i Phaser MR-programmet i CCP4 og bruge den raffinerede røntgenmodel til den første fælles raffinement. Brug derefter Phoenix forfine alene og fælles tilstande for x-ray alene raffinement, og den fælles neutron for x-ray raffinement. Efter hver runde af raffinement, manuelt kontrollere modellen mod Fo-Fc, og 2Fo-Fc positive nukleare tæthed kort i Coot.I disse repræsentative eksperimenter blev den bindende kapacitet af Hendra Virus afledt Hendra Virus One peptid til bat MHC klasse I brint kæder med homolog bat beta to mikroglobulin og heterologe menneskelige beta to mikroglobulin blev evalueret. I begge analyser blev krystaller med høj opløsning dannet ved renaturation med beta to mikroglobulin lyskæde. I mangel af beta to mikroglobulin dannes disse komplekser ikke.I MHC klasse I brintkæden Hendra Virus 1, human beta to mikroglobulin struktur, bevarede rester H31, D53, W60, og Y63 af human beta to mikroglobulin, som svarer til bat beta to mikroglobulin, komme i kontakt med bunden af peptid bindende groove og bevaret Q8, Y10, R12, og 24 rester, som svarer til beta to mikroglobuliner bundet til alfa tre domæne. I den samlede flagermus og menneskelige strukturer, den gennemsnitlige rod gennemsnitlige kvadratafledning af rester en til 184 af brint kæder er 0,248 under alle carbon alpha atom's superpositioner, hvilket tyder på, at der ikke er nogen forskelle mellem disse to komplekser. Strukturen af peptidjusteringen viser, at bekræftelserne af Hendra Virus en peptider i disse to komplekser er ret ens.Sekvensjustering viser også, at aminosyrerne i beta to mikroglobulin fra forskellige arter er stærkt bevaret. Det er vigtigt at tilbyde modstanderkomplekserne med en høj rapporteringseffektivitet. Derfor er det vigtigt at vælge passende beta to mikro globulin og til at bruge meget renset inklusion organer.Denne protokol kan bruges til at opnå stabile MTC I kompleks gennem potentielle beta to mikroglobulin substitutioner i andre arter, og at eksistere de er MTC I struktur og funktion. De data, der opnås fra disse undersøgelser kan bruges til at vurdere T-celle reaktioner under smitsomme sygdomme og tumor immunterapier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-til-struktur Bestemmelse af Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging af T-celle signalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Påvisning af autoreaktive CD4 T-celler i hjernen og hjertet Brug hovedhistokompatibilitetskompleks klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv og enkel metode til at etablere NK og T-cellelinier fra patienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfektion

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic drab Assay at vurdere immunologiske reaktioner mod bakterielle patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anvendelse af konsekvente massage lignende forstyrrelser på muse kalve og overvågning af de resulterende intramuskulære trykændringer

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Vurdering af udtryk for major histokompatibilitet Complex Klasse I på primær Murine Hippocampal Neurons af Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...