Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par le fonds ouvert du laboratoire clé d’État de la biotechnologie pharmaceutique, Université de Nan-jing, Chine (Subvention no. KF-GN-201905), la National Natural Science Foundation of China (subventions 81971501). William J. Liu est soutenu par l’Excellent Young Scientist Program de la NSFC (81822040) et beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

1. La préparation de l’expression construit
<ol><li>Récupérer les séquences des gènes de classe I du MHC (y compris les gènes prévus) à partir des chauves-souris de la base de données NCBI.</li>
	<li>Récupérez des séquences de chaînes lourdes MHC I plus élevées à partir de la Base de données sur l’immunomorphisme (DPI) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) et de la base de données UniProt (www.uniprot.org).</li>
	<li>Pour obtenir des complexes solubles de MHC, mutagenize les séquences pour enlever les régions...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

La construction d’un complexe protéique hybride par substitution héterologique de différents taxons est une stratégie commune pour les investigations fonctionnelles et structurelles lorsque le complexe homologue n’est pas disponible, comme dans le MHC I et ses ligands. Toutefois, il y a peu de résumé s’agissant de la méthodologie et de la technologie. Dans ce cas, la structure de la chauve-souris MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisée par bβ2m ou hβ2m a été analysée. Les acides aminés c...

Le principal complexe d’histocompatibilité (MHC) existe chez tous les vertébrés et est un ensemble de gènes qui détermine l’immunité à médiatté cellulaire contre les pathogènes infectieux. La classe I du MHC présente des peptides endogènes, tels que des composants viraux produits lors de l’infection virale, aux récepteurs des lymphocytes T (TCR) à la surface des lymphocytes CD8+ T pour jouer le rôle de médiateur de l’immunité cellulaire et participer à la régulationimmunitaire 1. Une étude structurale du MHC I liant aux peptides fournit des informations concernant les motifs de liaison peptidique et les caractéristiques de présentation par les molécules du MHC I, qui joue un rôle vital dans l’évaluation des réponses immunitaires deslymphocytes T CD8 + T et le développement du vaccin.
Depuis la première cristallisation et la détermination structurale du MHC I moléculaire par Bjorkman et coll.2, l’analyse de la structure cristalline des molécules du MHC I a grandement favorisé la compréhension de la façon dont les peptides se lient aux molécules du MHC I, et aide à comprendre l’interaction des chaînes légères avec les chaînes lourdes et les peptides. Une série d’études de suivi ont indiqué que bien que les gènes codant la chaîne lumineuse ne soient pas associés au MHC, la chaîne lumineuse est une protéine clé pour l’assemblage des molécules du MHC I3,4. Il interagit avec les trois domaines des molécules de classe I du MHC sur plusieurs surfaces. Lorsque la chaîne de lumière est absente, les molécules de classe I du MHC ne peuvent pas être correctement exprimées à la surface des cellules présentant des antigènes et ne peuvent pas interagir avec le TCR pour exercer leurs fonctions immunologiques.
Le MHC I est composé d’une chaîne lourde (chaîne H) et d’une chaîne légère (c.-à-d. β2microglobulines (β2m)), et est assemblé par liaison à un peptideapproprié 5. Le segment extracellulaire de la chaîne H se compose de domaines α1, α2 et α36. Les domaines α1 et α2 forment la rainure de liaison peptidique (PBG). La chaîne β2m agit comme une sous-unité structurelle du complexe d’assemblage du MHC I, stabilisant la conformation du complexe, et est un chaperon moléculaire pour le pliage de la chaîne MHC I H7,8,9. Une série d’études ont montré que le MHC I H s’enchaîne chez divers mammifères tels que la chauve-souris (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhésus macaque (Primates) (Mamu-B *17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, souris (Rodentia) (H-2Kd)14,15, chien (Carnivora) (DLA-88*50801)16, bovins (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 et équidés (Periss eqca-N*00602 et Eqca-N*00601)18 peuvent se combiner avec des β heterologousde 2m (tableau 1). Ces molécules hybrides sont souvent utilisées dans des études structurelles et fonctionnelles. Cependant, la méthodologie pour l’étude fonctionnelle et structurale du MHC I hybride avec des β2m n’est pas encore résumée. Pendant ce temps, la base structurelle de l’βde 2m entre les différents taxons reste incertaine.
Dans ce cas, la procédure d’expression, de refolding, de cristallisation, de collecte de données cristallines et de détermination de la structure est résumée. En outre, les substitutions potentielles de β2m de différentes espèces sont analysées en comparant la conformation structurelle du MHC I stabilisée par des β homologues et héterologiques de2m. Ces méthodes seront utiles pour poursuivre l’étude structurale du MHC I et l’évaluation de la réponse immunitaire des lymphocytes T CD8+ T dans le cancer et les maladies infectieuses.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

Le principal complexe d’histocompatibilité (MHC) joue un rôle central dans la présentation du peptide antigène et les réponses immunitaires des cellules T contre les maladies infectieuses et le développement tumoral. Le MHC hybride I complexé d’une substitution β2microglobulines (β2m) de différentes espèces peut être stabilisé in vitro. Il s’agit d’un moyen réalisable d’étudier le MHC I des mammifères, lorsque le β2m n’est pas disponible. Pendant ce temps, il est indiqué que la substitution β2m n’affecte pas significativement la présentation du peptide. Cependant, il y a peu de résumé s’agissant de la méthodologie et de la technologie du MHC hybride I complexés avec des β heterologous2-microglobuline (β2m). Ci-après, des méthodes d’évaluation de la faisabilité d’une substitution β2m dans l’étude MHC I sont présentées. Ces méthodes comprennent la préparation de constructions d’expression; la purification des organismes d’inclusion et le refolding du complexe du CSM; détermination de la thermostabilité des protéines; le criblage en cristal et la détermination de la structure. Cette étude fournit une recommandation pour comprendre la fonction et la structure du MHC I, et est également significative pour l’évaluation de réponse de cellule T pendant la maladie infectieuse et l’immunothérapie de tumeur.

Des travaux antérieurs ont rapporté que le peptide HeV1 (DFANTFLP) dérivé de HeV a été présenté par Ptal-N*01:0110,19. Dans ce cas, la capacité de liaison de ce peptide à Ptal-N*01:01 avec une chauve-souris homologue β2m (bβ2</fon...

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Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Le protocole décrit les méthodes expérimentales pour obtenir stable majeur complexe d’histocompatibilité (MHC) classe I grâce à des substitutions potentielles de β2-microglobuline (β2m) de différentes espèces. La comparaison structurale du MHC I stabilisée par des dommages homologues et β2m ont été étudiées.

Stabilité et structure du complexe histocompatibilité majeur de chauve-souris classe I avec β2-Microglobuline

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Dans cette étude, nous avons utilisé la classe I du CHSLD comme modèle pour résumer la méthodologie et évaluer la faisabilité d’une classe I hybride de MHC complexée de microglobuline bêta-2 héterologique. Des études antérieures ont montré que la substitution b2M des mammifères n’affecte pas significativement la présentation du peptide. En fait, la classe I hybride du MHC peut activer une structure et une fonction similaires à la molécule d’origine.Ces techniques peuvent être utilisées pour faciliter l’étude fonctionnelle et structurée du MHC I pour l’évaluation de la réponse tissulaire pendant la maladie infectieuse et l’immunothérapie tumorale. Pour la transformation de la culture E.coli ajouter 10 nanogrammes de plasmide contenant des chauves-souris ou des humains MHC Classe I bêta deux chaîne d’hydrogène microglobuline à 100 microlitres de suspension égalisée et baigner la suspension dans la glace pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, la chaleur choque les bactéries pendant 90 secondes à 42 degrés Celsius et retourne la culture au bain de glace pendant deux minutes.Ajoutez ensuite 800 microlitres de bouillon de lysogène à la culture, et secouez la suspension sur une plate-forme de basculement pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius, et 200 rotations par minute. À la fin de l’incubation, étendre 100 microlitres de la bactérie sur une lame de culture résistante aux antibiotiques appropriée. Le lendemain matin, choisissez un clone bactérien récemment transformé et inoculez le clone avec trois millilitres de LB avec un milieu antibiotique.Placez la culture sur la plate-forme de basculement à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Le lendemain matin, transférez 500 microlitres du stock bactérien activé en 50 millilitres de LB avec un milieu antibiotique, et retournez les bactéries à l’incubateur de basculement pendant la nuit. Divisez le stock bactérien activé restant en aliquots de 500 microlitres et ajoutez chaque aliquot à 500 volumes de microlitres de 40% glycérol, pour moins 80 degrés Celsius de stockage.Pour générer de grandes quantités de protéines recombinantes, le lendemain matin transférer la suspension bactérienne en deux litres de LB avec un milieu antibiotique à un rapport d’un à 100, et retourner la culture à l’incubateur de basculement jusqu’à ce qu’une absorption de 0,6 à 600 nanomètres est atteint. Ensuite, ajoutez un millimolar IPTG à la culture pour induire l’expression du gène trans. Après quatre à six heures d’induction, transférer la culture bactérienne dans des bouteilles pour centrifugation, et suspendre à nouveau les granulés de cellules bactériennes dans 60 millilitres de PBS par bouteille.Ensuite, libérez la protéine recombinante exprimée par perturbateur cellulaire ultrasonique 99 fois, pendant six secondes et un intervalle de 12 secondes à 300 Watts par sonication. Pour l’inclusion de purification du corps recueillir les bactéries sonicated par centrifugation et de suspendre à nouveau les granulés dans un volume approprié de tampon de lavage pour deux centrifugations supplémentaires. Après le deuxième lavage, suspendez à nouveau les corps d’inclusion et le tampon de re-suspension, et mettez de côté un aliquot de 20 microlitres de l’échantillon pour la page SDS pour tester la pureté du corps d’inclusion.Centrifugez le reste de l’échantillon et pesez le corps d’inclusion contenant des granulés. Ajouter le tampon de dissolution aux granulés à une concentration finale de 30 milligrammes de corps d’inclusion par millilitre de tampon. Et utilisez un agitateur magnétique pour remuer lentement la solution à quatre degrés Celsius, jusqu’à ce que les organes d’inclusion soient dissous dans le tampon de dissolution.Après avoir jeté les précipités, stockez les corps d’inclusion à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius. Pour le refolding complexe de MHC, ajoutez un glutathion réduit de cinq millimolar et un glutathion oxydé de 0,5 millimolar à 250 à 300 millilitres, un tampon de refolding de quatre degrés Celsius. Et remuer lentement la solution sur un agitateur magnétique à quatre degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes.Pour la chaîne hydrogène MHC et la dilution bêta-deux microglobulines, chargez le corps d’inclusion dans une seringue d’un millilitre et injectez tout le volume millilitre de solution corporelle d’inclusion dans un litre de tampon de refolding près de la barre de remue-remuer, pour obtenir une dilution rapide et efficace. Ensuite, dissoudre cinq milligrammes par millilitre de peptide dans le sulphoxide diméthyle, et injecter rapidement 200 microlitres de peptide dans la solution de refolding comme vient de le démontrer. Après 10 à 20 minutes d’agitation lente, injecter trois millilitres de corps d’inclusion de la chaîne H dans un nouveau volume d’un litre de tampon de refolding et permettre au refolding de procéder à quatre degrés Celsius pendant huit à 10 heures.Pour déterminer la concentration de protéines refolded ajouter tampon d’échange à une chambre pressurisée avec une membrane oxidase multi cuivre de 10 kilodalton, et concentrer le tampon à 30 à 50 millilitres de volume. Transférez la solution de refolding à un tube de centrifugeuse, et enlevez les précipités par centrifugation. Transférez soigneusement le superné dans la chambre et concentrez davantage le tampon sur un volume final d’environ un millilitre.Éliminez les contaminants finaux par centrifugation et transférez le supernate dans un tube stérile. Utilisez une colonne d’exclusion de la taille de 1030 GL pour purifier les protéines, recueillir les échantillons au sommet et les analyser à l’aide de la page SDS. Recueillir le pic complexe du MHC et concentrer la protéine à une concentration finale de 15 milligrammes par millilitre.Ensuite, diluer le complexe à 7,5 milligrammes par millilitre de concentration. Pour effectuer la cristallisation du MHC complexe et du peptide à l’aide de la technique de diffusion de vapeur de goutte assise, ajoutez 0,8 microlitres de l’échantillon à un cristal commercial et scellez la planche. Equilibrer la solution de l’échantillon contre 100 microlitres de solution de réservoir à quatre ou 18 degrés Celsius, et utiliser un microscope pour observer régulièrement la croissance du cristal au cours des six prochains mois.Pour une protection cryogénique, à la fin de l’expérience, transférer les cristaux vers une solution de stockage contenant 20% de glycérol avant de refroidir rapidement les échantillons dans un flux d’azote gazeux Kelvin à 100 degrés. Ensuite, collectez des données de diffraction aux rayons X selon les protocoles standard. Pour déterminer la structure des complexes cristallins, ouvrez les données structurales à haute résolution de diffraction des rayons X dans le programme Denzo dans le logiciel HK L 2000, et sélectionnez un modèle initial dans la banque de données protéiques.Pour déterminer la structure de la protéine, ouvrez les données du programme phaser MR en CCP4 et utilisez le modèle de rayons X raffiné pour le raffinement initial des articulations. Ensuite, utilisez le Phoenix affiner seul et les modes articulaires pour le raffinement des rayons X seul, et le neutron commun pour le raffinement des rayons X. Après chaque tour de raffinement, vérifiez manuellement le modèle par rapport au Fo-Fc, et 2Fo-Fc cartes de densité nucléaire positive à Coot.Dans ces expériences représentatives, les capacités contraignantes du virus Hendra ont dérivé le peptide Hendra Virus One pour battre les chaînes d’hydrogène de classe I du MHC avec la bêta-chauve-souris homologue deux microglobuline et la bêta humaine héterologeuse deux microglobulines ont été évaluées. Dans les deux analyses, des cristaux à haute résolution ont été formés par renaturation avec la bêta deux chaîne de lumière de microglobuline. En l’absence de bêta deux microglobulines, ces complexes ne se forment pas.Dans la chaîne hydrogène de classe I du MHC Hendra Virus un, bêta humaine deux microglobulines structure, résidus conservés H31, D53, W60, et Y63 de bêta humaine deux microglobulines, qui correspondent à la chauve-souris bêta deux microglobuline, entrer en contact avec le fond de la rainure de liaison peptidique et conservé Q8, Y10, R12, et 24 résidus, qui correspondent à la bêta deux microglobulines liées au domaine alpha trois. Dans l’ensemble des structures chauves-souris et humaines, la dérivation carrée moyenne des résidus de la racine moyenne de 1 à 184 des chaînes d’hydrogène est de 0,248 sous toutes les superpositions de l’atome alpha de carbone, ce qui indique qu’il n’y a aucune différence entre ces deux complexes. La structure de l’alignement peptidique montre que les confirmations de Hendra Virus un peptides dans ces deux complexes sont assez similaires.L’alignement des séquences montre également que les acides aminés de la bêta deux microglobulines de différentes espèces sont fortement conservés. Il est important d’offrir à l’adversaire des complexes avec une grande efficacité de déclaration. Par conséquent, il est crucial de sélectionner la bêta appropriée deux micro globulin et d’utiliser des corps d’inclusion hautement purifiés.Ce protocole peut être utilisé pour obtenir stable MTC I complexe grâce à la bêta potentielle deux substitutions de microglobuline chez d’autres espèces, et d’exister, ils sont MTC I structure et la fonction. Les données obtenues à partir de ces études peuvent être utilisées pour évaluer les réponses des cellules T lors des immunothérapies infectieuses et tumorales.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induction et d&#39;évaluation de la recombinaison commutateur de classe dans purifiée cellules B murines

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Recherche

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