Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Diese Studie wurde durch den offenen Fonds des staatlichen Schlüssellabors für pharmazeutische Biotechnologie, Nan-jing University, China (Grant-Nr. KF-GN-201905), die National Natural Science Foundation of China (Stipendien 81971501). William J. Liu wird vom Excellent Young Scientist Program der NSFC (81822040) und Beijing New-Star Plan of Science and Technology (Z181100006218080) unterstützt.

1. Vorbereitung von Ausdruckskonstrukten
<ol><li>Rufen Sie die Sequenzen von MHC-Genen der Klasse I (einschließlich vorhergesagter Gene) von Fledermäusen aus der NCBI-Datenbank ab.</li>
	<li>Holen Sie höhere MHC I schwere Kettensequenzen aus der Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) und der UniProt-Datenbank (www.uniprot.org) ab.</li>
	<li>Um lösliche MHC-Komplexe zu erhalten, mutagenisieren Sie die Sequenzen, um die zytosolischen und transmembranen Regionen zu entfernen.</li>
	<li>Klonen Sie d...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

Der Aufbau eines Hybridproteinkomplexes durch heterologe Substitution aus verschiedenen Taxa ist eine gemeinsame Strategie für funktionelle und strukturelle Untersuchungen, wenn der homologe Komplex nicht verfügbar ist, wie z. B. im MHC I und seinen Liganden. Allerdings gibt es eine begrenzte Zusammenfassung in Bezug auf die Methodik und die Technologie. Dabei wurde die Struktur der Fledermaus MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisiert durch b2m oder h2m, analysiert. Die wichtigsten Aminosäuren von β<sub...

Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) existiert in allen Wirbeltieren und ist eine Reihe von Genen, die die zellvermittelte Immunität gegen infektiöse Krankheitserreger bestimmen. MHC-Klasse I präsentiert endogene Peptide, wie virale Komponenten, die bei virus-Infektion produziert werden, T-Zellrezeptoren (TCR) auf der Oberfläche von CD8+ T-Zellen, um die zelluläre Immunität zu vermitteln und an der Immunregulation1teilzunehmen. Eine strukturelle Studie der Ankehrung von MHC I an Peptide liefert Informationen über Peptidbindungsmotive und Präsentationsmerkmale von MHC-I-Molekülen, die bei der Bewertung von CD8+ T-Zell-Immunantworten und der Impfstoffentwicklung eine entscheidende Rolle spielen.
Seit der ersten Kristallisation und strukturellen Bestimmung von MHC I molecular durch Bjorkman et al.2hat die Kristallstrukturanalyse von MHC I Molekülen das Verständnis der Bindung von Peptiden an MHC I Moleküle stark gefördert und hilft, die Wechselwirkung von Lichtketten mit schweren Ketten und Peptiden zu verstehen. Eine Reihe von Folgestudien zeigte, dass, obwohl die Gene, die die Lichtkette kodieren, nicht mit dem MHC verbunden sind, die Lichtkette ein Schlüsselprotein für die Montage von MHC I Molekülen3,4ist. Es interagiert mit den drei Domänen der MHC-Klasse I Moleküle auf mehreren Oberflächen. Wenn die Lichtkette fehlt, können MHC-Moleküle der Klasse I nicht korrekt auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen exprimiert werden und können nicht mit TCR interagieren, um ihre immunologischen Funktionen auszuüben.
MHC I besteht aus einer schweren Kette (H-Kette) und einer Leichten Kette (d.h. β 2-Mikroglobulin (β2m)) und wird durch Bindung an ein geeignetes Peptid5montiert. Das extrazelluläre Segment der H-Kette besteht aus den Domänen6, 1, 2 und 3 . Die Domänen 1 und 2 bilden die Peptidbindungsnut (PBG). Die β2m Kette fungiert als strukturelle Untereinheit des Montagekomplexes in MHC I, stabilisiert die Konformation des Komplexes und ist ein molekulares Chaperon für MHC I H Kettenfaltung7,8,9. Eine Reihe von Studien haben gezeigt, dass MHC I H Ketten von verschiedenen Säugetieren wie Fledermaus (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus makaken (Primaten) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, Maus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, Hund (Carnivora) (DLA-88*50801)16, Rinder (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 und Pferde (Perissodactyla) (Eqca-N*00602 und Eqca-N*00601)18 können mit heterologen β2m (Tabelle 1) kombinieren. Diese Hybridmoleküle werden häufig in strukturellen und funktionellen Studien verwendet. Die Methodik für die funktionelle und strukturelle Untersuchung des hybriden MHC I mit heterologen β2m ist jedoch noch nicht zusammengefasst. Unterdessen bleibt die strukturelle Grundlage für die ausgetauschte β2m zwischen verschiedenen Taxa unklar.
Hierin werden das Verfahren für MHC I Expression, Umfaltung, Kristallisation, Kristalldatenerfassung und Strukturbestimmung zusammengefasst. Darüber hinaus werden mögliche Substitutionen von β2m von verschiedenen Arten durch vergleicht die strukturelle Konformation von MHC I durch homologe und heterologe β2m stabilisiert. Diese Methoden werden für weitere MHC I Strukturstudie und CD8+ T-Zell-Immunantwort-Bewertung bei Krebs und Infektionskrankheiten hilfreich sein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) spielt eine zentrale Rolle bei der Darstellung von Antigenpeptid und T-Zell-Immunreaktionen gegen Infektionskrankheiten und Tumorentwicklung. Die hybride MHC I, komplexiert mit heterologen β 2-Mikroglobulin (β2m) Substitution verschiedener Arten kann in vitro stabilisiert werden. Dies ist ein praktikables Mittel, um MHC I von Säugetieren zu untersuchen, wenn die homologe β2m nicht verfügbar ist. In der Zwischenzeit wird darauf hingewiesen, dass Die β2m Substitution die Peptiddarstellung nicht signifikant beeinflusst. Allerdings gibt es eine begrenzte Zusammenfassung hinsichtlich der Methodik und der Technologie für den Hybrid MHC I, der mit heterologen β2-Mikroglobulin (β2m) komplexiert ist. Hierin werden Methoden zur Bewertung der Durchführbarkeit heterologer β2m Substitution in der MHC-I-Studie vorgestellt. Diese Methoden umfassen die Vorbereitung von Ausdruckskonstrukten. Reinigung von Inklusionskörpern und Umfaltung des MHC-Komplexes; Bestimmung der Protein-Thermostabilität; Kristallsiebung und Strukturbestimmung. Diese Studie bietet eine Empfehlung zum Verständnis der Funktion und Struktur von MHC I und ist auch wichtig für die Bewertung der T-Zell-Reaktion während der Infektionskrankheit und Tumorimmuntherapie.

Frühere Arbeiten berichteten, dass das HeV-abgeleitete HeV1 (DFANTFLP) Peptid von Ptal-N* 01:0110,19vorgestellt wurde. Dabei wurde die Bindungskapazität dieses Peptids an Ptal-N*01:01 mit homologe Fledermaus β2m (b 2<font face...

Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Das Protokoll beschreibt experimentelle Methoden zur Erlangung stabiler Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC) Klasse I durch potenzielle β 2-Mikroglobulin(β2m) Substitutionen verschiedener Arten. Untersucht wurde der strukturelle Vergleich von MHC I, der durch homologe und heterologe β2m stabilisiert wurde.

Stabilität und Struktur der Fledermaus Haupt Histokompatibilität Komplex Klasse I mit heterologen β2-Mikroglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

In dieser Studie verwendeten wir Bat MHC Class I als Modell, um die Methodik zusammenzufassen und die Machbarkeit einer hybriden MHC-Klasse zu bewerten, die mit heterologem Beta-2-Mikroglobulin komplexiert ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass die B2M-Substitution des Säugetiers die Peptiddarstellung nicht signifikant beeinflusst. Tatsächlich kann die hybride MHC-Klasse I eine ähnliche Struktur und Funktion wie das ursprüngliche Molekül aktivieren.Diese Techniken können verwendet werden, um die funktionelle und strukturierte Untersuchung von MHC I für die Gewebereaktionsbewertung während der Infektionskrankheit und Tumorimmuntherapie zu erleichtern. Für die E.coli-Kulturtransformation fügen Sie 10 Nanogramm Plasmid, das Fledermäuse oder menschliche MHC-Klasse I enthält, beta zwei Mikroglobulin-Wasserstoffkette zu 100 Mikroliter nequalisierte Suspension und baden die Suspension in Eis für 30 Minuten. Am Ende der Inkubation schockieren Die Hitze die Bakterien 90 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius und bringen die Kultur für zwei Minuten ins Eisbad zurück.Als nächstes fügen Sie 800 Mikroliter Lysogeny Brühe in die Kultur, und schütteln Sie die Suspension auf einer Schaukelplattform für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius, und 200 Umdrehungen pro Minute. Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter der Bakterien auf eine geeignete antibiotikaresistente Kulturklinge verteilen. Am nächsten Morgen wählen Sie einen einzigen kürzlich transformierten bakteriellen Klon und impfen Sie den Klon mit drei Millilitern LB mit Antibiotikum.Stellen Sie die Kultur 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius auf die Schaukelplattform. Am nächsten Morgen 500 Mikroliter des aktivierten Bakterienbestandes in 50 Milliliter LB mit Antibiotikum übertragen und die Bakterien über Nacht in den Schaukelbrutkasten zurückbringen. Teilen Sie den verbleibenden aktivierten Bakterienbestand in 500 Mikroliter Aliquots auf und fügen Sie jedes Aliquot zu 500 Mikroliter Volumen von 40% Glycerin hinzu, für eine Speicherung von minus 80 Grad Celsius.Um große Mengen an rekombinantem Protein zu erzeugen, übertragen Sie am nächsten Morgen die bakterielle Suspension in zwei Liter LB mit Antibiotikum im Verhältnis eins bis 100 und geben Sie die Kultur in den Schaukelbrutkasten zurück, bis eine Absorption von 0,6 bei 600 Nanometern erreicht ist. Fügen Sie dann eine Millimolar IPTG zur Kultur hinzu, um die Expression des Transgens zu induzieren. Nach vier bis sechs Stunden Induktion die Bakterienkultur zur Zentrifugation auf Flaschen übertragen und die bakteriellen Zellpellets in 60 Milliliter PBS pro Flasche wieder aufhängen.Befreien Sie dann das exprimierte rekombinante Protein durch Ultraschallzellstörer 99 Mal, für sechs Sekunden und ein Intervall von 12 Sekunden bei 300 Watt pro Beschallung. Zur Inklusionskörperreinigung die beschallten Bakterien durch Zentrifugation sammeln und die Pellets in einem geeigneten Waschpuffer volumen für zwei zusätzliche Zentrifugationen wieder aufhängen. Nach der zweiten Wäsche die Einschlusskörper und den Wiedersuspensionspuffer erneut aussetzen und einen 20-Mikroliter-Aliquot der Probe für die SDS-Seite beiseite legen, um die Reinheit des Inklusionskörpers zu testen.Zentrifugieren Sie die verbleibende Probe und wiegen Sie den einschlusskörper, der Pellet enthält. Fügen Sie den Pellets auflösungspuffer zu einer Endkonzentration von 30 Milligramm Inklusionskörper pro Milliliter Puffer hinzu. Und verwenden Sie einen magnetischen Rührer, um die Lösung langsam bei vier Grad Celsius zu rühren, bis sich die Einschlusskörper im Auflösungspuffer auflösen.Nach dem Wegwerfen der Ausfällungen die Einschlusskörper bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius lagern. Für MHC-Komplex-Umfalten, fügen Sie eine fünf Millimolar reduziert Glutathion und 0,5 Millimolar oxidierteGlutathion bei 250 bis 300 Milliliter, ein vier Grad Celsius Umfaltungspuffer. Und rühren Sie die Lösung langsam auf einem Magnetrührer bei vier Grad Celsius für 10 bis 20 Minuten.Für MHC Wasserstoffkette und Beta zwei Mikroglobulin Verdünnung, laden Sie den Einschlusskörper in eine Ein-Milliliter-Spritze und injizieren sie das gesamte ein Milliliter Volumen der Inklusionskörperlösung in einen Liter Umfaltungspuffer in der Nähe der Rührstange, um eine schnelle und effiziente Verdünnung zu erhalten. Als nächstes fünf Milligramm pro Milliliter Peptid in Dimethylsulfoxid auflösen und schnell 200 Mikroliter Peptid in die Umfaltlösung injizieren, wie gerade gezeigt. Nach 10 bis 20 Minuten langsamen Rührens drei Milliliter H-Ketten-Einschlusskörper in ein neues Einliter-Volumen des Umfaltpuffers injizieren und die Umfaltung bei vier Grad Celsius für acht bis zehn Stunden ermöglichen.Zur Bestimmung der neu gefalteten Proteinkonzentration geben Sie einer Druckkammer mit einer 10 Kilodalton Multi-Kupfer-Oxidase-Membran einen Austauschpuffer hinzu und konzentrieren den Puffer auf 30 bis 50 Milliliter Volumen. Übertragen Sie die Umfaltlösung auf ein Zentrifugenrohr, und entfernen Sie die Ausscheidungen durch Zentrifugation. Übertragen Sie das Supernate vorsichtig in die Kammer und konzentrieren Sie den Puffer weiter auf ein Endvolumen von etwa einem Milliliter.Entfernen Sie alle endgültigen Verunreinigungen durch Zentrifugation und übertragen Sie das Supernate in ein steriles Rohr. Verwenden Sie eine dreihundert GL-Maximale Ausschlussspalte, um die Proteine zu reinigen, die Proben in der Spitze zu sammeln und sie mithilfe der SDS-Seite zu analysieren. Sammeln Sie den MHC-Komplex Peak und konzentrieren Sie das Protein auf eine Endkonzentration von 15 Milligramm pro Milliliter.Dann verdünnen Sie den Komplex auf 7,5 Milligramm pro Milliliter Konzentration. Um die Kristallisation des komplexen MHC und Peptids mit der Sitting Drop Vapor Diffusionstechnik durchzuführen, fügen Sie 0,8 Mikroliter der Probe auf eine kommerzielle Kristallplatte und versiegeln Sie die Platine. Gleichgewichten Sie die Probenlösung gegen 100 Mikroliter Reservoirlösung bei vier oder 18 Grad Celsius, und verwenden Sie ein Mikroskop, um das Kristallwachstum in den nächsten sechs Monaten regelmäßig zu beobachten.Zum kryogenen Schutz übertragen Sie die Kristalle am Ende des Experiments in eine Speicherlösung, die 20 % Glycerin enthält, bevor Sie die Proben in einem 100 Grad Kelvin gasförmigen Stickstoffstrom schnell abkühlen. Dann sammeln Sie Röntgenbeugungsdaten nach Standardprotokollen. Um die Struktur der Kristallkomplexe zu bestimmen, öffnen Sie die hochauflösenden strukturellen Röntgenbeugungsdaten im Denzo-Programm innerhalb des SOFTWAREpakets HK L 2000, und wählen Sie ein erstes Modell in der Proteindatenbank aus.Um die Struktur des Proteins zu bestimmen, öffnen Sie die Daten im Phaser MR-Programm in CCP4 und verwenden Sie das verfeinerte Röntgenmodell für die anfängliche Gelenkverfeinerung. Verwenden Sie dann die Phoenix-Verfeinerung allein und Gelenkmodi für die Röntgen-Alleinverfeinerung und das Gelenkneutron für die Röntgenverfeinerung. Überprüfen Sie nach jeder Verfeinerungsrunde das Modell manuell mit dem Fo-Fc und den 2Fo-Fc-Karten für die positive Kerndichte in Coot.In diesen repräsentativen Experimenten wurden die Bindungskapazitäten des Hendra-Virus abgeleitet Hendra Virus One Peptid mHC Klasse I Wasserstoffketten mit homologe Fledermaus beta zwei Mikroglobulin und heterologe menschliche Beta zwei Mikroglobulin untersucht. In beiden Analysen wurden Kristalle mit hoher Auflösung durch Renaturierung mit der Beta-Zwei-Mikroglobulin-Lichtkette gebildet. In Ermangelung von Beta zwei Mikroglobulin, Diese Komplexe bilden sich nicht.In der Wasserstoffkette Hendra Virus der MHC-Klasse I menschliche Beta zwei Mikroglobulin-Struktur, konservierte Rückstände H31, D53, W60, und Y63 des menschlichen Beta zwei Mikroglobulin, die Fledermaus Beta zwei Mikroglobulin entsprechen, nehmen Kontakt mit der Unterseite der Peptidbindung Nut und konserviert Q8, Y10, R12, und 24 Rückstände, die die Beta zwei Mikroglobuline an die Alpha-drei-Domäne gebunden entsprechen. In der Gesamtfledermaus und menschlichen Strukturen, die durchschnittliche Wurzel mittlere quadratische Ableitung von Rückständen ein bis 184 der Wasserstoffketten ist 0,248 unter allen Kohlenstoff-Alpha-Atom-Überlagerungen, was darauf hindeutet, dass es keine Unterschiede zwischen diesen beiden Komplexen. Die Struktur der Peptidausrichtung zeigt, dass die Bestätigungen des Hendra Virus ein Peptide in diesen beiden Komplexen ziemlich ähnlich sind.Die Sequenzausrichtung zeigt auch, dass die Aminosäuren von Beta zwei Mikroglobulin aus verschiedenen Arten hochkonserviert sind. Es ist wichtig, den gegnerischen Komplexen eine hohe Reporting-Effizienz anzubieten. Daher ist es wichtig, geeignete stutziertes Beta-Mikroglobulin auszuwählen und hochgereinigte Einschlusskörper zu verwenden.Dieses Protokoll kann verwendet werden, um stabile MTC I Komplex durch mögliche Beta zwei Mikroglobulin Substitutionen in anderen Arten zu erhalten, und zu existieren, sie sind MTC I Struktur und Funktion. Die aus diesen Studien gewonnenen Daten können verwendet werden, um T-Zell-Reaktionen während Infektionskrankheiten und Tumorimmuntherapien zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Mikrowelle Assisted Schnelle Diagnose von Plant Virus Erkrankungen durch Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Multi-Target-Parallel Processing Ansatz zur Gene-to-Struktur Bestimmung der Influenza Polymerase PB2-Untereinheit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Bewertung des Ausdrucks der Haupthistokompatibilität scomplex Klasse I auf primären murine nurinischen Hippocampus-Neuronen durch Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...