Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal fondo aperto del laboratorio statale chiave di biotecnologia farmaceutica, Università di Nan-jing, Cina (Grant no. KF-GN-201905), la National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 81971501). William J. Liu è supportato dall'Excellent Young Scientist Program della NSFC (81822040) e dal Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

1. Preparazione dei costrutti di espressione
<ol><li>Recupera le sequenze dei geni di classe I dell'MHC (inclusi i geni previsti) dai pipistrelli dal database NCBI.</li>
	<li>Recuperare sequenze di catene pesanti MHC I di mammiferi superiori dal database ipd (Immuno Polymorphism Database) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) e dal database UniProt (www.uniprot.org).</li>
	<li>Per ottenere complessi MHC solubili, mutagenizzare le sequenze per rimuovere le regioni citosoliche e transmembrane.</li>
	<li>Clonare i geni che codificano g...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

La costruzione di un complesso proteico ibrido attraverso la sostituzione eterologo da diversi taxa è una strategia comune per le indagini funzionali e strutturali quando il complesso omologo non è disponibile, come nell'MHC I e nei suoi ligandi. Tuttavia, vi è una sintesi limitata per quanto riguarda la metodologia e la tecnologia. Qui è stata analizzata la struttura del pipistrello MHC I, Ptal-N*01:01, stabilizzata da bβ2m o hβ2m. Gli amminoacidi chiave di β2m che si legano a Pta...

Il principale complesso di istocompatibilità (MHC) esiste in tutti i vertebrati ed è un insieme di geni che determina l'immunità mediata dalle cellule agli agenti patogeni infettivi. La classe MHC I presenta peptidi endogeni, come componenti virali prodotti dopo l'infezione da virus, ai recettori delle cellule T (TCR) sulla superficie delle cellule CD8+ T per mediare l'immunità cellulare e partecipare alla regolazione immunitaria1. Uno studio strutturale dell'MHC I che si lega ai peptidi fornisce informazioni sui motivi di legame peptidico e sulle caratteristiche di presentazione da parte delle molecole MHC I, che svolge un ruolo vitale nella valutazione delle risposteimmunitarie delle cellule CD8 + T e nello sviluppo del vaccino.
Sin dalla prima cristallizzazione e determinazione strutturale dell'MHC I molecolare di Bjorkman etal. Una serie di studi di follow-up ha indicato che sebbene i geni che codificano la catena luminosa non siano associati all'MHC, la catena luminosa è una proteina chiave per l'assemblaggio delle molecole di MHC I3,4. Interagisce con i tre domini delle molecole di classe I dell'MHC su più superfici. Quando la catena luminosa è assente, le molecole di classe I dell'MHC non possono essere espresse correttamente sulla superficie delle cellule che presentano antigeni e non possono interagire con il TCR per esercitare le loro funzioni immunologiche.
MHC I è composto da una catena pesante (catena H) e catena leggera (cioè β2-microglobulina (β 2 m)), ed èassemblato attraversoil legame con un peptideadatto 5. Il segmento extracellulare della catena H è costituito da α1, α2 e α3 domini6. I domini α1 e α2 formano il solco di legame peptidico (PBG). La catena β2m agisce come una subunità strutturale del complesso di assemblaggio in MHC I, stabilizzando la conformazione del complesso, ed è un chaperone molecolare per la piegatura della catena MHC I H7,8,9. Una serie di studi hanno dimostrato che mhc I H catene da vari mammiferi come pipistrello (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus macaque (Primati) (Mamu -B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, topo (Rodentia) (H-2Kd)14,15, cane (Carnivora) (DLA-88*50801)16,bovini (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 ed equini (Perissodactyla) (Eqca-N*00602 ed Eqca-N*00601)18 possono combinarsi con β eterologadi 2m(tabella 1). Queste molecole ibride sono spesso utilizzate in studi strutturali e funzionali. Tuttavia, la metodologia per lo studio funzionale e strutturale dell'MHC I ibrido con β2m non è ancora riassunta. Nel frattempo, la base strutturale per l'β2milioni tra diversi taxa rimane poco chiara.
Nel presente documento vengono riassunte la procedura per l'espressione MHC I, il ripieliatura, la cristallizzazione, la raccolta dei dati cristallini e la determinazione della struttura. Inoltre, le potenziali sostituzioni di β 2 m da diverse specievengonoanalizzate confrontando la conformazione strutturale dell'MHC I stabilizzata da β2m omologi ed eterologi. Questi metodi saranno utili per ulteriori studi strutturali MHC I e valutazione della rispostaimmunitaria delle cellule CD8 + T nel cancro e nelle malattie infettive.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

Il principale complesso di istocompatibilità (MHC) svolge un ruolo fondamentale nella presentazione del peptide antigene e nelle risposte immunitarie delle cellule T contro le malattie infettive e lo sviluppo tumorale. L'MHC I ibrido complesso con sostituzione eterologo β 2-microglobulina (β2m) da diverse specie può essere stabilizzato in vitro. Questo è un mezzo fattibile per studiare l'MHC I dei mammiferi, quando l'β2m non è disponibile. Nel frattempo, è indicato che il βsostituzione di 2m non influisce in modo significativo sulla presentazione peptidica. Tuttavia, c'è una sintesi limitata per quanto riguarda la metodologia e la tecnologia per l'MHC ibrido I complessa con β eterologo2-microglobulina (β2m). Nel presente documento vengono presentati metodi per valutare la fattibilità βsostituzione eterologodi 2 m nello studio MHC I. Questi metodi includono la preparazione di costrutti di espressione; purificazione dei corpi di inclusione e ripiezione del complesso MHC; determinazione della termostabilità proteica; screening cristallino e determinazione della struttura. Questo studio fornisce una raccomandazione per la comprensione della funzione e della struttura dell'MHC I ed è anche significativo per la valutazione della risposta delle cellule T durante le malattie infettive e l'immunoterapia tumorale.

Lavori precedenti riportavano che il peptide HeV1 (DFANTFLP) derivato da HeV era presentato da Ptal-N*01:0110,19. Nel presente documento è stata valutata la capacità di legame di questo peptide a Ptal-N*01:01 con pipistrello omologo β2m (bβ<font face="Helvetica Neue, Arial, sans-serif...

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Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Il protocollo descrive metodi sperimentali per ottenere sostituzioni stabili del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) classe Iattraversopotenziali sostituzioni di β 2-microglobulina (β2m) da diverse specie. Sono stati studiati il confronto strutturale dell'MHC I stabilizzato da β omologo edeterologodi 2 m.

Stabilità e struttura del pipistrello Maggiore Istocompatibilità Complesso Classe I con Eterolologo β2-Microglobulina

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

In questo studio, abbiamo utilizzato Bat MHC Classe I come modello per riassumere la metodologia e valutare la fattibilità di una classe MHC ibrida I complessa con microglobulina beta-2 eterologo. Studi precedenti hanno dimostrato che la sostituzione del B2M dei mammiferi non influisce in modo significativo sulla presentazione peptidica. Infatti, l'ibrido MHC Classe I può attivare una struttura e una funzione simili alla molecola originale.Queste tecniche possono essere utilizzate per facilitare lo studio funzionale e strutturato dell'MHC I per la valutazione della risposta tissutale durante le malattie infettive e l'immunoterapia tumorale. Per la trasformazione della coltura di E.coli aggiungere 10 nanogrammi di plasmide contenente pipistrello o MHC classe I umana beta due catena di idrogeno microglobulina a 100 microlitri di sospensione equalizzata e bagnare la sospensione nel ghiaccio per 30 minuti. Alla fine dell'incubazione, il calore ha scioccato i batteri per 90 secondi a 42 gradi Celsius e ha restituito la coltura al bagno di ghiaccio per due minuti.Quindi aggiungi 800 microlitri di brodo di licogenia alla coltura e scuoti la sospensione su una piattaforma a dondolo per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto. Alla fine dell'incubazione, stendere 100 microlitri dei batteri su un'appropriata lama di coltura resistente agli antibiotici. La mattina dopo, scegli un singolo clone batterico recentemente trasformato e inocula il clone con tre millilitri di LB con mezzo antibiotico.Posiziona la cultura sulla piattaforma a dondolo a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. La mattina seguente, trasferire 500 microlitri dello stock batterico attivato in 50 millilitri di LB con mezzo antibiotico e riportare i batteri nell'incubatrice di dondolo durante la notte. Dividere il materiale batterico attivo rimanente in 500 aliquote microliter e aggiungere ogni aliquota a 500 volumi di microliteri del 40% di glicerolo, per meno 80 gradi Celsius di stoccaggio.Per generare grandi quantità di proteine ricombinanti, la mattina successiva trasferire la sospensione batterica in due litri di LB con mezzo antibiotico a un rapporto uno a 100 e riportare la coltura all'incubatore di dondolo fino a raggiungere un'assorbanza di 0,6 a 600 nanometri. Quindi, aggiungere un IPTG millimolare alla coltura per indurre l'espressione del gene trans. Dopo quattro o sei ore di induzione, trasferire la coltura batterica in bottiglie per la centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet di cellule batteriche in 60 millilitri di PBS per bottiglia.Quindi liberare la proteina ricombinante espressa dal disgregatore cellulare ad ultrasuoni 99 volte, per sei secondi e un intervallo di 12 secondi a 300 Watt per sonicazione. Per l'inclusione la purificazione del corpo raccoglie i batteri sonicati mediante centrifugazione e sospende i pellet in un volume appropriato di tampone di lavaggio per due centrifugazioni aggiuntive. Dopo il secondo lavaggio, sospendere di nuovo i corpi di inclusione e il tampone di nuova sospensione e mettere da parte un'aliquota di 20 microliter del campione per la pagina SDS per testare la purezza del corpo di inclusione.Centrifugare il campione rimanente e pesare il corpo di inclusione contenente pellet. Aggiungere il tampone di dissoluzione al pellet a una concentrazione finale di 30 milligrammi di corpo di inclusione per millilitro di tampone. E utilizzare un agitatore magnetico per mescolare lentamente la soluzione a quattro gradi Celsius, fino a quando i corpi di inclusione non vengono sciolti nel tampone di dissoluzione.Dopo aver scartato i precipitati, conservare i corpi di inclusione a meno 20 o meno 80 gradi Celsius. Per il ripiessiamento complesso MHC, aggiungere un glutatione ridotto di cinque millimolari e un glutatione ossidato millimolare da 0,5 millimolare a 250-300 millilitri, un tampone di ripiezione di quattro gradi Celsius. E mescolare lentamente la soluzione su un agitatore magnetico a quattro gradi Celsius per 10-20 minuti.Per la catena di idrogeno MHC e la diluizione beta di due microglobuline, caricare il corpo di inclusione in una siringa da un millilitro e iniettare l'intero volume di un millilitro di soluzione del corpo di inclusione in un litro di tampone di ripiezione vicino alla barra di agitazione, per ottenere una diluizione rapida ed efficiente. Successivamente, sciogliere cinque milligrammi per millilitro di peptide nel dimetil solfossido e iniettare rapidamente 200 microlitri di peptide nella soluzione di ripiezione come appena dimostrato. Dopo 10-20 minuti di agitazione lenta, iniettare tre millilitri di corpi di inclusione della catena H in un nuovo volume di un litro di tampone di ripiezione e consentire al ripieleggio di procedere a quattro gradi Celsius per otto-10 ore.Per determinare la concentrazione di proteine ripiedata aggiungere tampone di scambio a una camera pressurizzata con una membrana di ossidasi multi-rame da 10 kilodalton e concentrare il buffer a un volume da 30 a 50 millilitri. Trasferire la soluzione di ripiegatura in un tubo di centrifuga e rimuovere i precipitati mediante centrifugazione. Trasferire con cura il supernate nella camera e concentrare ulteriormente il buffer su un volume finale di circa un millilitro.Rimuovere eventuali contaminanti finali mediante centrifugazione e trasferire il supernato in un tubo sterile. Utilizzare una colonna di esclusione di diecitrecento GL per purificare le proteine, raccogliendo i campioni al picco e analizzandoli utilizzando la pagina SDS. Raccogliere il picco complesso MHC e concentrare la proteina ad una concentrazione finale di 15 milligrammi per millilitro.Quindi diluire il complesso a 7,5 milligrammi per concentrazione di millilitro. Per eseguire la cristallizzazione del complesso MHC e peptide utilizzando la tecnica di diffusione del vapore a goccia seduta, aggiungere 0,8 microlitri del campione a una tavola di cristallo commerciale e sigillare la scheda. Equilibrare la soluzione del campione rispetto a 100 microlitri di soluzione di serbatoio a quattro o 18 gradi Celsius e utilizzare un microscopio per osservare regolarmente la crescita del cristallo nei prossimi sei mesi.Per la protezione criogenica, al termine dell'esperimento, trasferire i cristalli in una soluzione di stoccaggio contenente il 20% di glicerolo prima di raffreddare rapidamente i campioni in un flusso di azoto gassoso Kelvin di 100 gradi. Quindi raccogliere i dati di diffrazione dei raggi X secondo i protocolli standard. Per determinare la struttura dei complessi cristallini, aprire i dati di diffrazione strutturale a raggi X ad alta risoluzione nel programma Denzo all'interno del pacchetto software HK L 2000, e selezionare un modello iniziale nella banca dati delle proteine.Per determinare la struttura della proteina, aprire i dati nel phaser MR Program in CCP4 e utilizzare il raffinato modello a raggi-X per il perfezionamento iniziale del giunto. Quindi utilizzare la fenice affinare da sola e le modalità di giunto per la sola raffinazione a raggi X, e il neutrone articolare per la raffinatezza a raggi X. Dopo ogni ciclo di perfezionamento, controllare manualmente il modello rispetto al Fo-Fc e le mappe di densità nucleare positiva 2Fo-Fc in Coot.In questi esperimenti rappresentativi, sono state valutate le capacità di legame del peptide Hendra Virus One derivato da Hendra Virus One per battere le catene di idrogeno MHC classe I con pipistrello beta omologo due microglobulina ed eterologo umano beta due microglobuline. In entrambe le analisi, cristalli ad alta risoluzione si sono formati attraverso la rinaturazione con la catena luminosa beta a due microglobuline. In assenza di beta due microglobuline, questi complessi non si formano.Nella catena di idrogeno MHC classe I Hendra Virus uno, la struttura umana beta due microglobuline, residui conservati H31, D53, W60 e Y63 della microglobulina beta umana, che corrispondono alla bat beta due microglobuline, vengono a contatto con il fondo della scanalatura di legame peptidico e conservano residui Q8, Y10, R12 e 24, che corrispondono alle beta due microglobuline legate ai tre domini alfa. Nelle strutture complessive dei pipistrelli e dell'uomo, la derivazione media quadratica della radice dei residui da uno a 184 delle catene di idrogeno è 0,248 sotto tutte le sovrapposizioni dell'atomo alfa di carbonio, indicando che non ci sono differenze tra questi due complessi. La struttura dell'allineamento peptidico mostra che le conferme di Hendra Virus un peptidi in questi due complessi sono abbastanza simili.L'allineamento delle sequenze mostra anche che gli amminoacidi di beta due microglobuline di diverse specie sono altamente conservati. È importante offrire ai complessi avversari un'elevata efficienza di reporting. Pertanto, è fondamentale selezionare beta due micro globulina adatti e utilizzare corpi di inclusione altamente purificati.Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un complesso MTC I stabile attraverso potenziali sostituzioni beta due microglobuline in altre specie, e per esistere sono struttura e funzione MTC I. I dati ottenuti da questi studi possono essere utilizzati per valutare le risposte delle cellule T durante le malattie infettive e le immunoterapie tumorali.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Ricerca

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