Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

이 연구는 제약 생명 공학의 국가 핵심 실험실의 오픈 펀드에 의해 지원되었다, 난징 대학, 중국 (그랜트 번호. KF-GN-201905), 중국 국립 자연과학 재단 (보조금 81971501). 윌리엄 J. 리우NSFC (81822040)와 베이징 신스타 과학 기술 계획 (Z18100006218080)의 우수 젊은 과학자 프로그램에 의해 지원됩니다.

1. 식 구문 준비
<ol><li>NCBI 데이터베이스에서 박쥐에서 MHC 클래스 I 유전자(예측 유전자 포함)의 서열을 검색합니다.</li>
	<li>면역 다형성 데이터베이스(ipD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) 및 UniProt 데이터베이스(www.uniprot.org)로부터 더 높은 포유류 MHC I 헤비 체인 서열을 검색합니다.</li>
	<li>수용성 MHC 복합체를 얻으려면 서열을 돌연변이하여 세포및 막 횡단 영역을 제거합니다.</li>
	<li>박쥐 Ptal-N*01:01의 자궁 도?...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

다른 taxa로부터 이종 대체를 통한 하이브리드 단백질 복합체의 시공은 MHC I 및 리간드와 같이 동종 복합체가 제공되지 않을 때 기능및 구조적 조사를 위한 일반적인 전략이다. 그러나 방법론 및 기술에 대한 요약은 제한적입니다. 본명, 박쥐 MHC I, Ptal-N*01:01의 구조, bβ2m 또는 hβ2m에 의해 안정화된 구조가 분석되었다. Ptal-N*01:01에 결합하는 β2m의주요 아미노산은 박쥐와 인간...

주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 모든 척추 동물에 존재하며 전염성 병원체에 대한 세포 매개 면역을 결정하는 유전자 세트입니다. MHC 클래스 I는 바이러스 감염시 생성된 바이러스 성분과 같은 내인성 펩티드를CD8+ T 세포 표면에 T 세포 수용체(TCR)에 제시하여 세포 면역을 중재하고 면역 조절1에참여한다. 펩티드에 결합하는 MHC I의 구조 연구는 CD8+ T 세포 면역 반응 및 백신 개발의 평가에 중요한 역할을 하는 MHC I 분자에 의한 펩티드 결합 모티프 및 프리젠테이션 기능에 관한 정보를 제공합니다.
BJorkman 외2에의한 MHC I 분자의 첫 번째 결정화 및 구조적 결정 이후, MHC I 분자의 결정 구조 분석은 펩티드가 MHC I 분자에 결합하는 방법에 대한 이해를 크게 촉진하고, 무거운 사슬 및 펩티드와 광사슬의 상호 작용을 이해하는 데 도움이 된다. 일련의 후속 연구는 광 사슬을 코딩하는 유전자가 MHC와 관련이 없지만, 광 사슬은 MHC I 분자3,4의조립을 위한 핵심 단백질임을 나타냈다. 그것은 여러 표면에 MHC 클래스 I 분자의 세 가지 도메인과 상호 작용. 광사슬이 없을 때, MHC 급 I 분자는 항원 제시 세포의 표면에 정확하게 표현될 수 없고 그들의 면역 기능을 발휘하기 위하여 TCR과 상호 작용할 수 없습니다.
MHC I는 중형 체인(H 체인)과 라이트 체인(즉,β 2-마이크로글로불린(β2m)으로구성되며, 적합한 펩타이드5에결합하여 조립된다. H 사슬의 세포외 세그먼트는 α1, α2 및 α3 도메인6로구성됩니다. α1 및 α2 도메인은 펩타이드 결합 홈(PBG)을 형성한다. β2m체인은 MHC I내 조립 단지의 구조적 서브유닛으로서 작용하여 복합체의 변형을 안정화하고, MHC I H 체인 접이식7,8,9에대한 분자 샤페론이다. 일련의 연구에 따르면 MHC I H 체인은 박쥐(Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10,레서스 마카크(영장류) (마무-B*17)11 (마무-A*01)12 (마무-A*02)13,마우스(로드엔티아)13,마우스(로드텐티아) 2K(14-14) 등 다양한 포유류로부터체인을 보였다.5,개 (카니보라) (DLA-88 *50801)16,가축 (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 및 말 (페리소다실라) (Eqca-N * 00602 및 Eqca-N * 00601)18 그는 18 과 결합 할 수있습니다.β...2.1. 이 하이브리드 분자는 종종 구조적 및 기능적 연구에서 사용됩니다. 그러나, 이종성 β2m를가진 하이브리드 MHC I의 기능및 구조 연구를 위한 방법론은 아직 요약되지 않는다. 한편, 서로 다른 택시 사이의 β2m의구조적 기반은 불분명합니다.
본명, MHC I 발현, 재접이식, 결정화, 결정데이터 수집 및 구조 결정에 대한 절차가 요약된다. 또한, 상이한 종으로부터β 2m의잠재적 대체는 동종 및 이종β2m에의해 안정화된 MHC I의 구조적 형성을 비교하여 분석된다. 이러한 방법은 암 및 전염병에서 추가 MHC I 구조 연구 및 CD8+ T 세포 면역 반응 평가에 도움이 될 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

주요 조직 적합성 복합체(MHC)는 전염병 및 종양 발달에 대한 항원 펩타이드 프리젠테이션 및 T 세포 면역 반응에서 중추적인 역할을 한다. 이종β2-마이크로글로불린(β2m)으로복합된 하이브리드 MHC는 체외에서 안정화될 수 있다. 이것은 동종 β2m를사용할 수 없을 때 포유류의 MHC I를 연구하는 가능한 수단입니다. 한편, 포유류 β2m대체가 펩타이드 프리젠테이션에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 이종성 β 2-마이크로글로불린(β2m)으로복합된 하이브리드 MHC에 대한 방법론 및기술에 관한 요약이 제한되어 있다. 본명, 이종성의 타당성을 평가하는 방법은 MHC에서2m치환β 연구가 제시된다. 이러한 메서드에는 식 구문 준비가 포함됩니다. 포함 체의 정화 및 MHC 복합체의 재접기; 단백질 열안정성의 결정; 크리스탈 스크리닝 및 구조 결정. 본 연구는 MHC I의 기능 및 구조를 이해하기 위한 권장 사항을 제공하며, 또한 전염병 및 종양 면역 요법 중 T 세포 반응 평가를 위해 유의하다.

이전 작품은 HeV 유래 HeV1 (DFANTFLP) 펩티드가 Ptal-N*01:0110,19에의해 제시되었다고 보고했다. 본 명세서에서, 상동성 박쥐β 2m(bβ2m) 및 이종인간 β2m(hβ<font face="Helvetica Neue, Arial, sans-se...

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Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

이 프로토콜은 다른 종으로부터 잠재적 인 β2-microglobulin (β2m)대체를 통해 안정적인 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I를 얻는 실험 방법을 설명합니다. 동종 β2m에의해 안정화된 MHC I의 구조적 비교가 조사되었다.

배트 메이저 조직적합성 복합클래스 1등급 의 안정성 및구조 β 2-마이크로글로불린

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

이 연구에서는 Bat MHC Class I를 모델로 사용하여 방법론을 요약하고 이종성 베타-2 마이크로글로불린으로 복잡한 하이브리드 MHC 클래스의 타당성을 평가했습니다. 이전 연구는 포유류 B2M 대체펩티드 프리젠 테이션에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 사실, 하이브리드 MHC 클래스 는 본래 분자와 유사한 구조및 기능을 활성화할 수 있다.이러한 기술은 전염병 및 종양 면역 요법 동안 조직 반응 평가를 위해 MHC I의 기능및 구조화 연구를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 대장균 배양 변환을 위해 박쥐 또는 인간 MHC 클래스를 함유하는 플라스미드 10 나노그램을 100 마이크로글로불린 수소 사슬을 100 마이크로리터에 베타하고 30분 동안 얼음에서 현탁액을 목욕시킵니다. 인큐베이션이 끝나면 박테리아를 섭씨 42도에서 90초 동안 열충격을 주어 2분간 얼음 욕조로 문화를 되돌려 보겠습니다.다음으로 800 마이크로리터의 리소제니 국물을 문화에 추가하고, 섭씨 37도에서 20분 동안 흔들 플랫폼에서 서스펜션을 흔들고 분당 200회 회전합니다. 인큐베이션이 끝나면 박테리아의 100 마이크로리터를 적절한 항생제 내성 배양 블레이드에 퍼뜨리게 됩니다. 다음 날 아침, 최근에 변형된 단일 세균 클론을 선택하고 항생제 배지를 가진 LB의 3밀리리터로 클론을 접종합니다.12~16시간 동안 37도의 흔들림 을 위해 흔들 기위에 문화를 놓습니다. 다음 아침, 활성 세균성 스톡 의 500 마이크로리터를 항생제 배지로 LB의 50 밀리리터로 옮기고 박테리아를 하룻밤 동안 흔들 인큐베이터로 돌려보라고 한다. 나머지 활성 세균 성 육수를 500 마이크로 리터 알리쿼트로 나누고 각 알리코트를 섭씨 80도 저장에 대해 40 % 글리세롤의 500 마이크로 리터 볼륨에 추가합니다.다량의 재조합 단백질을 생성하기 위해, 다음날 아침 세균현탁액을 항생제 배지를 1 내지 100 비율로 LB 2리터로 옮기고, 600나노미터에서 0.6의 흡광도가 달성될 때까지 배양을 흔들 인큐베이터로 되돌려 한다. 이어서, 트랜스 유전자의 발현을 유도하기 위해 배양에 1밀리머 IPTG를 첨가한다. 4~6시간의 유도 후, 세균 배양을 원심분리용 병으로 옮기고, 병당 PBS의 60밀리리터에서 세균세포 펠릿을 다시 중단한다.그런 다음 초음파 세포 파괴기99회, 초음파당 300와트에서 12초 간격으로 발현된 재조합 단백질을 99회 해방한다. 포함 된 신체 정화에 대 한 원심 분리에 의해 초음파 박테리아를 수집 하 고 두 개의 추가 원심 분리에 대 한 세척 버퍼의 적절 한 볼륨에서 펠 릿을 다시 중단. 두 번째 세척 후 포함 바디 및 재서스펜션 버퍼를 다시 중단하고, SDS 페이지에 대한 샘플의 20 마이크로리터 알리쿼트를 따로 떼어 내어 포함 체순도를 테스트한다.나머지 샘플을 원심분리하고 펠릿을 포함하는 포함 체의 무게를 측정합니다. 버퍼밀리리터당 30밀리그램의 포함 체에 펠릿에 용해 버퍼를 추가합니다. 그리고 자기 교반기를 사용하여 용액을 섭씨 4도에서 천천히 저어주며, 포함 된 몸이 용해 버퍼에 용해 될 때까지.침전을 버린 후 포함 된 몸을 영하 20도 또는 영하 80도로 저장하십시오. MHC 복합재폴딩의 경우, 글루타티온 5밀리머감소글루타티온과 0.5 밀리머 산화 글루타티온을 250~300밀리리터에 추가하면 섭씨 4도의 재폴딩 버퍼를 넣습니다. 그리고 10~20분 동안 4°C에서 자기 교반기에서 용액을 천천히 저어줍니다.MHC 수소 체인 및 베타 2개의 마이크로글로불린 희석의 경우, 포함 체를 1밀리리터 주사기에 적재하고 포함 체액 의 1리터 부피를 교반 바 근처의 재접이식 버퍼 1리터에 주입하여 빠르고 효율적인 희석을 얻습니다. 다음으로, 디메틸 설프산화물에 펩티드 밀리리터 당 5 밀리그램을 용해하고, 방금 입증된 바와 같이 200마이크로리터의 펩티드를 재빨리 재보딩 용액에 주입한다. 10-20분간의 느린 교반 후, H 체인 포함 바디 3밀리리터를 새로운 1리터 의 재접이식 버퍼에 주입하고 8~10시간 동안 섭씨 4도에서 재폴딩을 진행할 수 있도록 합니다.재접힌 단백질 농도를 결정하기 위해 10킬로달톤 다중 구리 산화막으로 가압 챔버에 교환 버퍼를 추가하고 완충액을 30~50밀리리터 부피로 농축한다. 재접이식 용액을 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리에 의한 침전액을 제거한다. 슈퍼네이트를 조심스럽게 챔버로 옮기고 버퍼를 약 1 밀리리터의 최종 부피로 농축합니다.원심분리에 의해 최종 오염 물질을 제거하고 슈퍼네이트를 멸균 튜브로 옮긴다. 10300개의 GL 크기 배제 컬럼을 사용하여 단백질을 정화하고, 피크시 샘플을 수집하고, SDS 페이지를 사용하여 분석합니다. MHC 복합 피크를 수집하고 밀리리터 당 15 밀리그램의 최종 농도로 단백질을 농축합니다.그런 다음 복합체를 밀리리터 농도당 7.5 밀리그램으로 희석합니다. 착석 낙하 증기 확산 기술을 사용하여 복잡한 MHC 및 펩타이드의 결정화를 수행하기 위해, 시료의 0.8 마이크로리터를 상업용 결정보드에 추가하고 보드를 밀봉한다. 4또는 18도에서 100 마이크로리터의 저수지 용액에 대한 샘플 용액을 상화하고 현미경을 사용하여 향후 6개월 동안 의정 성장을 정기적으로 관찰합니다.극저온 보호를 위해, 실험의 끝에서, 100도 켈빈 기체 질소 스트림에서 시료를 빠르게 냉각하기 전에 20% 글리세롤을 포함하는 저장 용액으로 결정을 전송합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 x선 회절 데이터를 수집합니다. 결정 복합체의 구조를 결정하기 위해 HK L 2000 소프트웨어 패키지 내에서 Denzo 프로그램에서 고해상도 구조 X선 회절 데이터를 열고 단백질 데이터 뱅크에서 초기 모델을 선택합니다.단백질의 구조를 결정하기 위해 CCP4의 Phaser MR 프로그램에서 데이터를 열고 초기 관절 정제를 위해 정제된 X-ray 모델을 사용합니다. 그런 다음 X선 단독으로 미세 조정을 위해 피닉스 세련미와 조인트 모드를 사용하며, X선 세련미를 위해 조인트 중성자를 사용합니다. 각 라운드의 개선 후, 수동으로 Fo-Fc에 대한 모델을 확인하고, 쿠트의 2Fo-Fc 긍정적 인 핵 밀도지도.이러한 대표적인 실험에서, 헨드라 바이러스 유래 헨드라 바이러스 1 펩타이드의 결합 능력은 동종 박쥐 베타 2개의 마이크로글로불린 및 이종성 인간 베타 2개의 마이크로글로불린을 가진 MHC 클래스 I 수소 사슬을 박쥐로 펩티드하였다. 두 분석 모두, 고해상도를 가진 결정은 베타 2개의 마이크로글로불린 광사슬을 가진 레나튜레이션을 통해 형성되었다. 베타 2개의 마이크로글로불린이 없는 경우, 이러한 복합체는 형성되지 않는다.MHC 클래스 I 수소 사슬 헨드라 바이러스 1, 인간 베타 2 마이크로글로불린 구조에서, 배트 베타 2마이크로글로불린에 해당하는 인간 베타 2개의 마이크로글로불린의 H31, D53, W60 및 Y63의 보존잔류는 펩타이드 결합 홈의 바닥과 접촉하고 Q8, Y10, R12 및 24잔류를 보존하여 베타 2마이크로글로불에 결합된 3개의 마이크로글로불에 해당한다. 전체 박쥐와 인간 구조물에서, 수소 사슬의 1~184잔류의 평균 루트 평균 제곱유도는 탄소 알파 원자의 모든 중첩하에서 0.248이며, 이는 이 두 복합체 사이에 차이가 없음을 나타낸다. 펩티드 정렬의 구조는 이 두 복합체에서 헨드라 바이러스 하나의 펩티드의 확인이 매우 유사하다는 것을 보여줍니다.서열 정렬은 또한 다른 종에서 베타 2 마이크로 글로불린의 아미노산이 높게 보존된다는 것을 보여줍니다. 높은 보고 효율을 가진 적대단지를 제공하는 것이 중요합니다. 따라서 적합한 베타 2 마이크로 글로불린을 선택하고 고도로 정제된 포함 바디를 사용하는 것이 중요합니다.이 프로토콜은 다른 종에서 잠재적 인 베타 2 마이크로 글로불린 대체를 통해 복잡한 안정적인 MTC I를 획득하는 데 사용할 수 있으며, 존재하기 위해 MTC I 구조 및 기능입니다. 이러한 연구에서 얻은 데이터는 전염병 및 종양 면역 요법 중 T 세포 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

연구

면역학 및 감염병학

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

전자 레인지 전송 전자 현미경으로 식물 바이러스 질병의 신속한 진단을 도와

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

마우스 종아리에 일관된 마사지와 같은 섭동을 적용하고 근육 내 압력 변화를 모니터링

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

유동 세포에 의한 주요 조직 적합성 복합 클래스 1의 표현 평가

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...