Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Denne studien ble støttet av det åpne fondet for statlige viktige laboratorier for farmasøytisk bioteknologi, Nan-jing University, Kina (Grant no. KF-GN-201905), National Natural Science Foundation of China (bevilgninger 81971501). William J. Liu støttes av Excellent Young Scientist Program fra NSFC (81822040) og Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

1. Utarbeidelse av uttrykk konstruerer
<ol><li>Hent sekvensene av MHC klasse I gener (inkludert spådde gener) fra fra NCBI-databasen.</li>
	<li>Hent høyere pattedyr MHC I tunge kjedesekvenser fra Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) og UniProt-databasen (www.uniprot.org).</li>
	<li>For å oppnå løselige MHC-komplekser muterer du sekvensene for å fjerne de cytosoliske og transmembraneområdene.</li>
	<li>Klone genene koding ectodomains av Ptal-N * 01: 01 (GenBank nr. KT987929...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

Byggingen av et hybridproteinkompleks gjennom heterologisk substitusjon fra ulike taxa er en vanlig strategi for funksjonelle og strukturelle undersøkelser når homologkomplekset ikke er tilgjengelig, for eksempel i MHC I og dets ligandes. Det er imidlertid begrenset oppsummering av metodikken og teknologien. Heri ble strukturen til MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisert av bβ2m eller hβ2m analysert. De viktigste aminosyrene til β2m binding til Ptal-N * 01: 01 ble funnet å være bevart mel...

Det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) finnes i alle virveldyr og er et sett med gener som bestemmer den cellemedierte immuniteten mot smittsomme patogener. MHC klasse I presenterer endogene peptider, for eksempel viruskomponenter produsert ved virusinfeksjon, til T cellereseptorer (TCR) på overflaten av CD8+ T-celler for å megle cellulær immunitet og delta i immunregulering1. En strukturell studie av MHC I binding til peptider gir informasjon om peptidbindende motiver og presentasjonsfunksjoner av MHC I molekyler, som spiller viktige roller i evalueringen av CD8+ T celle immunresponser og vaksineutvikling.
Siden den første krystalliseringen og strukturelle bestemmelsen av MHC I molekylær av Bjorkman et al. 2 , har krystallstrukturanalysen av MHCI-molekyleri stor grad fremmet forståelsen av hvordan peptider binder seg til MHC I molekyler, og bidrar til å forstå samspillet mellom lette kjeder med tunge kjeder og peptider. En rekke oppfølgingsstudier indikerte at selv om genene som koder lyskjeden ikke er forbundet med MHC, er lyskjeden et viktig protein for montering av MHCI-molekyler 3,4. Den samhandler med de tre domenene i MHC klasse I molekyler på flere overflater. Når lyskjeden er fraværende, kan mhc klasse I molekyler ikke uttrykkes riktig på overflaten av antigen-presentere celler og kan ikke samhandle med TCR for å utøve sine immunologiske funksjoner.
MHC I består av et tungt kjede (H-kjede) og lett kjede (f.eks. β2-mikroglobulin (β2m)), og monteres gjennom binding til et egnet peptid5. Det ekstracellulære segmentet av H-kjeden består av α1-, α2- og α3-domener6. α1- og α2-domenene danner peptidbindingssporet (PBG). Den β2m kjeden fungerer som en strukturell underenhet av monteringskomplekset i MHC I, stabiliserer konformasjonen av komplekset, og er en molekylær chaperone for MHC I H kjede folding7,8,9. En rekke studier har vist at MHC I H kjeder fra ulike pattedyr som (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10, rhesus macaque (Primates) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, hund (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, storfe (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 og equine (Perissod (Eqca-N*00602 og Eqca-N*00601)18 kan kombineres med heterolog β2m (tabell 1). Disse hybridmolekylene brukes ofte i strukturelle og funksjonelle studier. Metoden for den funksjonelle og strukturelle studien av hybrid MHC I med heterologøse β2m er imidlertid ennå ikke oppsummert. Samtidig er det strukturelle grunnlaget for det omskiftede β2m mellom ulike taxa fortsatt uklart.
Heri oppsummeres prosedyren for MHC I-uttrykk, refolding, krystallisering, krystalldatainnsamling og strukturbestemmelse. I tillegg analyseres potensielle substitusjoner på β2m fra forskjellige arter gjennom å sammenligne den strukturelle konformasjonen av MHC I stabilisert av homolog og heterolog β2m. Disse metodene vil være nyttige for videre MHC I strukturell studie og CD8+ T celle immunrespons evaluering i kreft og smittsomme sykdommer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

Det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) spiller en avgjørende rolle i antigenpeptidpresentasjon og T-celle immunresponser mot smittsom sykdom og tumorutvikling. Hybrid MHC I kompleks med heterolog β2-microglobulin (β2m) substitusjon fra forskjellige arter kan stabiliseres in vitro. Dette er et mulig middel for å studere MHC I av pattedyr, når homologe β2m ikke er tilgjengelig. I mellomtiden er det indikert at β2m substitusjon ikke påvirker peptidpresentasjonen betydelig. Det er imidlertid begrenset oppsummering av metodikken og teknologien for hybrid MHC I kompleks med heterolog β2-microglobulin (β2m). Her presenteres metoder for å evaluere muligheten for heterolog β2m substitusjon i MHC I-studien. Disse metodene inkluderer utarbeidelse av uttrykkskonstruksjoner; rensing av inklusjonsorganer og refolding av MHC-komplekset; bestemmelse av protein termobilitet; krystall screening og struktur bestemmelse. Denne studien gir en anbefaling for å forstå funksjon og struktur av MHC I, og er også viktig for T celle respons evaluering under smittsom sykdom og tumor immunterapi.

Tidligere arbeid rapporterte at HeV-avledet HeV1 (DFANTFLP) peptid ble presentert av Ptal-N * 01:0110,19. Heri ble bindingskapasiteten til dette peptidet til Ptal-N*01:01 med homolog β2m (bβ2<font face="Helvetica Neue, Arial, s...

Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Protokollen beskriver eksperimentelle metoder for å oppnå stabile store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I gjennom potensielle β 2-mikroglobulin (β2m) substitusjoner fra forskjellige arter. Den strukturelle sammenligningen av MHC I stabilisert av homolog og heterolog β2m ble undersøkt.

Stabilitet og struktur av Bat Major Histocompatibility Complex klasse I med heterologøse β2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

I denne studien brukte vi Bat MHC klasse I som modell for å oppsummere metodikken, og for å evaluere gjennomførbarheten av en hybrid MHC klasse jeg kompleks med heterolog beta-2 mikroglobulin. Tidligere studier har vist at den pattedyrske B2M-substitusjonen ikke påvirker peptidpresentasjonen betydelig. Faktisk kan hybrid MHC klasse I aktivere en lignende struktur og funksjon til det opprinnelige molekylet.Disse teknikkene kan brukes til å lette den funksjonelle og strukturerte studien av MHC I for vevsresponsevaluering under smittsom sykdom og tumorimmunterapi. For E.coli kultur transformasjon legge til 10 nanograms av plasmid som inneholder eller menneskelig MHC klasse I beta to microglobulin hydrogen kjede til 100 mikroliter av utjevn suspensjon og bade suspensjonen i is i 30 minutter. På slutten av inkubasjonen, varme sjokk bakteriene i 90 sekunder ved 42 grader Celsius, og returnere kulturen til isbadet i to minutter.Deretter legger du til 800 mikroliter lysogeny kjøttkraft til kulturen, og rist suspensjonen på en gyngeplattform i 20 minutter ved 37 grader Celsius, og 200 rotasjoner per minutt. På slutten av inkubasjonen sprer du 100 mikroliter av bakteriene på et passende antibiotikaresistent kulturblad. Neste morgen, plukke en enkelt nylig forvandlet bakteriell klone og inokulere klone med tre milliliter LB med antibiotika medium.Plasser kulturen på gyngeplattformen på 37 grader Celsius i 12 til 16 timer. Neste morgen, overføre 500 mikroliter av aktivert bakteriell lager i 50 milliliter LB med antibiotika medium, og returnere bakteriene til gynge inkubator over natten. Del de resterende aktiverte bakteriebestandene i 500 mikroliter aliquots og legg til hver aliquot til 500 mikroliter volumer på 40% glyserol, for minus 80 grader Celsius lagring.For å generere store mengder rekombinant protein, neste morgen overføre bakteriell suspensjon i to liter LB med antibiotika medium på en en til 100 ratio, og returnere kulturen til gynge inkubator til en absorbans på 0,6 ved 600 nanometer oppnås. Deretter legger du til en millimolar IPTG til kulturen for å indusere uttrykk for transgenet. Etter fire til seks timers induksjon, overfør bakteriekulturen til flasker for sentrifugering, og re-suspendere bakterielle cellepellets i 60 milliliter PBS per flaske.Frigjør deretter det uttrykte rekombinante proteinet ved ultralydcelleforstyrr 99 ganger, i seks sekunder og et intervall på 12 sekunder ved 300 watt per sonikering. For inkludering kroppsrensing samle sonikerte bakterier ved sentrifugering og re-suspendere pellets i et passende volum av vaskebuffer for to ekstra sentrifugeringer. Etter den andre vasken, re-suspendere inkludering organer og re-suspensjon buffer, og sette til side en 20 mikroliter aliquot av prøven for SDS side for å teste inkludering kroppen renhet.Sentrifuger den gjenværende prøven, og veie inklusjonsorganet som inneholder pellet. Legg oppløsning buffer til pellets til en endelig konsentrasjon på 30 milligram inkludering kroppen per milliliter buffer. Og bruk en magnetisk rører til å sakte røre løsningen ved fire grader Celsius, til inklusjonslegemene er oppløst i oppløsningsbufferen.Etter å ha kastet utfellingene, oppbevar inklusjonsorganene på minus 20 eller minus 80 grader Celsius. For MHC kompleks omfolding, legg til en fem millimolar redusert glutation og 0,5 millimolar oksidert glutation ved 250 til 300 milliliter, en fire grader Celsius refolding buffer. Og rør sakte løsningen på en magnetisk rører ved fire grader Celsius i 10 til 20 minutter.For MHC hydrogenkjede og beta to mikroglobulin fortynning, laste inkludering kroppen i en ett milliliter sprøyte og injisere hele ett milliliter volum av inkludering kroppen løsning i en liter refolding buffer nær rørestangen, for å oppnå en rask og effektiv fortynning. Deretter oppløse fem milligram per milliliter peptid i dimetylsulfoksid, og raskt injisere 200 mikroliter peptid i refolding løsningen som nettopp demonstrert. Etter 10 til 20 minutter med langsom omrøring, injiser tre milliliter av H-kjedens inklusjonsorganer i et nytt en liters volum av ommappebuffer og la omleggingen fortsette med fire grader Celsius i åtte til 10 timer.For å bestemme den refolded proteinkonsentrasjon legge utveksling buffer til et trykksatt kammer med en 10 kilodalton multi kobber oksidase membran, og konsentrere bufferen til 30 til 50 milliliter volum. Overfør refoldingsløsningen til et sentrifugerør, og fjern utfellingene ved sentrifugering. Overfør forsiktig overnaten til kammeret og konsentrat bufferen ytterligere til et endelig volum på omtrent en milliliter.Fjern eventuelle endelige kontaminanter ved sentrifugering og overfør supernaten til et sterilt rør. Bruk en kolonne for ekskludering av ti hundre GL-størrelse til å rense proteinene, samle prøvene på toppen og analysere dem ved hjelp av SDS-siden. Samle MHC kompleks topp og konsentrere proteinet til en endelig konsentrasjon på 15 milligram per milliliter.Deretter fortynne komplekset til 7,5 milligram per milliliter konsentrasjon. For å utføre krystallisering av den komplekse MHC og peptid ved hjelp av sittende drop dampdiffusjonsteknikk, tilsett 0,8 mikroliter av prøven til et kommersielt krystallbrett og forsegle brettet. Likevekt prøveløsningen mot 100 mikroliter reservoarløsning ved fire eller 18 grader Celsius, og bruk et mikroskop for å observere krystallveksten regelmessig i løpet av de neste seks månedene.For kryogen beskyttelse, på slutten av forsøket, overføre krystallene til en lagringsløsning som inneholder 20% glyserol før du raskt kjøler prøvene i en 100 graders Kelvin gassholdig nitrogenstrøm. Deretter samler du inn røntgendiffraksjonsdata i henhold til standardprotokoller. For å bestemme strukturen i krystallkompleksene, åpne de høyoppløselige strukturelle røntgendiffraksjonsdataene i Denzo-programmet i HK L 2000-programvarepakken, og velg en innledende modell i proteindatabanken.For å bestemme proteinets struktur, åpne dataene i Phaser MR-programmet i CCP4, og bruk den raffinerte røntgenmodellen for den første felles raffinementet. Bruk deretter Phoenix-avgrensing alene og felles moduser for røntgen alene raffinement, og felles nøytron for røntgenraffinement. Etter hver runde med raffinement, manuelt sjekke modellen mot Fo-Fc, og 2Fo-Fc positiv kjernefysisk tetthet kart i Coot.I disse representative eksperimentene, bindingskapasiteten til Hendra Virus avledet Hendra Virus One peptid til bat MHC klasse I hydrogen kjeder med homolog bat beta to microglobulin og heterolog human beta to microglobulin ble evaluert. I begge analysene ble krystaller med høy oppløsning dannet gjennom renning med betaen to mikroglobulin lyskjede. I fravær av beta to mikroglobulin dannes disse kompleksene ikke.I MHC klasse I hydrogenkjeden Hendra Virus en, human beta to mikroglobulin struktur, bevartrester H31, D53, W60, og Y63 av human beta to mikroglobulin, som tilsvarer bat beta to microglobulin, ta kontakt med bunnen av peptid binding groove og bevart Q8, Y10, R12, og 24 rester, som tilsvarer beta to mikroglobuliner bundet til alfa tre domene. I den totale og menneskelige strukturer er den gjennomsnittlige roten gjennomsnittlig firkantet avledning av rester en til 184 av hydrogenkjedene 0,248 under alle karbon alfaatomets superposisjoner, noe som indikerer at det ikke er noen forskjeller mellom disse to kompleksene. Strukturen av peptid justering viser at bekreftelser av Hendra Virus en peptider i disse to kompleksene er ganske like.Sekvensjustering viser også at aminosyrene i beta to mikroglobulin fra forskjellige arter er svært bevart. Det er viktig å tilby motstanderkompleksene høy rapporteringseffektivitet. Derfor er det avgjørende å velge egnet beta to mikro globulin og å bruke svært renset inkludering organer.Denne protokollen kan brukes til å oppnå stabil MTC I kompleks gjennom potensielle beta to mikroglobulin substitusjoner i andre arter, og for å eksistere de er MTC I struktur og funksjon. Dataene hentet fra disse studiene kan brukes til å vurdere T-celleresponser under smittsomme sykdommer og tumorimmunterapier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-til-struktur Fastsettelse av Influensa Polymerase PB2 underenhet

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging av T-celle signalisering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Påvisning av autoreaktive CD4 T-celler i hjernen og hjertet Bruke store histocompatibility komplekse klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv og enkel metode for å etablere NK og T cellelinjer fra pasienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfeksjon

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic drepe analysen å vurdere immunologiske svar mot bakteriell patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anvendelse av konsekvent massasje-lignende forstyrrelser på mus kalver og overvåking av resulterende intramuskulær trykk endringer

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Vurdere uttrykket for major histokompatibilitet Kompleks klasse I på Primær Murine Hippocampal Neurons av Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...