Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo fundo aberto do laboratório de biotecnologia farmacêutica da Universidade de Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (concede 81971501). William J. Liu é apoiado pelo Excelente Programa de Jovens Cientistas do NSFC (81822040) e pelo Plano de Ciência e Tecnologia de Pequim (Z181100006218080).

1. Preparação de construções de expressão
<ol><li>Recuperar as sequências de genes classe I do MHC (incluindo genes previstos) de morcegos do banco de dados NCBI.</li>
	<li>Recuperar maiores sequências de cadeia pesada mhc i do Banco de Dados de Polimorfismo de Imuno (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) e do banco de dados UniProt (www.uniprot.org).</li>
	<li>Para obter complexos solúveis de MHC, mutagenize as sequências para remover as regiões citosolicas e transmembranas.</li>
	<li>Clone os genes que codificam os ...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

A construção de um complexo proteico híbrido por meio de substituição heteróloga de diferentes taxas é uma estratégia comum para investigações funcionais e estruturais quando o complexo homólogo não está disponível, como no MHC I e seus ligantes. No entanto, há uma resumida limitada em relação à metodologia e à tecnologia. Aqui, foi analisada a estrutura do morcego MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizada por bβ2m ou hβ2m. Os principais aminoácidos de β ligação de2m ao P...

O maior complexo de histocompatibilidade (MHC) existe em todos os vertebrados e é um conjunto de genes que determina a imunidade mediada por células a patógenos infecciosos. A classe I do MHC apresenta peptídeos endógenos, como componentes virais produzidos após a infecção por vírus, aos receptores de células T (TCR) na superfície das células CD8+ T para mediar a imunidade celular e participar da regulação imunológica1. Um estudo estrutural de MHC I vinculando-se aos peptídeos fornece informações sobre motivos de ligação de peptídeos e características de apresentação por moléculas de MHC I, que desempenha papéis vitais na avaliação das respostas imunes de células CD8+ T e desenvolvimento de vacinas.
Desde a primeira cristalização e determinação estrutural do MHC I molecular por Bjorkman et al.2, a análise da estrutura cristalina das moléculas de MHC I promoveu muito a compreensão de como os peptídeos se ligam às moléculas de MHC I, e ajuda a entender a interação das cadeias leves com correntes pesadas e peptídeos. Uma série de estudos de acompanhamento indicaram que, embora os genes que codificam a cadeia de luz não esteja associados ao MHC, a cadeia de luz é uma proteína chave para o montagem de moléculas de MHC I3,4. Ele interage com os três domínios das moléculas da classe I do MHC em múltiplas superfícies. Quando a cadeia de luz está ausente, as moléculas classe I do MHC não podem ser corretamente expressas na superfície das células que apresentam antígenos e não podem interagir com o TCR para exercer suas funções imunológicas.
MHC I é composto por uma corrente pesada (cadeia H) e cadeia leve (ou seja, β 2-microglobulina (β2m)), e é montado através de ligação a um peptídeo adequado5. O segmento extracelular da cadeia H consiste nos domínios α1, α2 e α36. Os domínios α1 e α2 formam o sulco de ligação de peptídeo (PBG). A cadeia βde 2m atua como subunidade estrutural do complexo conjunto em MHC I, estabilizando a conformação do complexo, e é uma acompanhante molecular para a cadeia MHC I H dobrando7,8,9. Uma série de estudos mostraram que cadeias MHC I H de vários mamíferos, como morcego (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus macaque (Primatas) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mouse (Rodentia) (H-2Kd)14,15, cão (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, gado (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 e equino (Periss eodactyla) (Eqca-N*00602 e Eqca-N*00601)18 podem combinar com heterologos β2m(Tabela 1). Essas moléculas híbridas são frequentemente usadas em estudos estruturais e funcionais. No entanto, ainda não está resumida a metodologia para o estudo funcional e estrutural do HÍBRIDO MHC I com β heterologos de2m. Enquanto isso, a base estrutural para o intercambio β2m entre diferentes taxas permanece incerta.
Aqui, o procedimento para expressão de MHC I, redobramento, cristalização, coleta de dados de cristal e determinação da estrutura são resumidos. Além disso, são analisadas substituições potenciais de β2m de diferentes espécies através da comparação da conformação estrutural do MHC I estabilizada por β homônomo e heteróloga de2m. Esses métodos serão úteis para mais estudo estrutural MHC I e avaliação de resposta imune de células CD8+ T em câncer e doenças infecciosas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

O maior complexo de histocompatibilidade (MHC) desempenha um papel fundamental na apresentação de peptídeos de antígeno e respostas imunes de células T contra doenças infecciosas e desenvolvimento de tumores. O MHC híbrido I complexo com β substituição heterologous β 2-microglobulina (β2m) de diferentes espécies pode ser estabilizado in vitro. Este é um meio viável para estudar MHC I de mamíferos, quando o homólogo β2m não está disponível. Enquanto isso, é indicado que a substituição de mamíferos β2m não afeta significativamente a apresentação de peptídeos. No entanto, há uma resumida limitada em relação à metodologia e à tecnologia para o MHC híbrido I complexizado com heterologos β 2-microglobulina (β2m). Nesse meio, são apresentados métodos para avaliar a viabilidade da β substituição de2m no estudo MHC I. Esses métodos incluem a preparação de construtos de expressão; purificação de corpos de inclusão e redobramento do complexo mhc; determinação da termoestabilidade proteica; triagem de cristal e determinação da estrutura. Este estudo fornece uma recomendação para a compreensão da função e estrutura do MHC I, e também é significativo para avaliação de resposta celular T durante doenças infecciosas e imunoterapia tumoral.

Trabalhos anteriores relataram que o peptídeo HeV-derivado do HeV (DFANTFLP) foi apresentado por Ptal-N*01:0110,19. Aqui, foi avaliada a capacidade de ligação deste peptídeo para Ptal-N*01:01 com morcego homólogo β2m (bβ2m...

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Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

O protocolo descreve métodos experimentais para obter substituições estáveis do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I através de substituições potenciais β 2-microglobulina (β2m) de diferentes espécies. A comparação estrutural do MHC I estabilizada por homólogos e heteromaníacos β2m foram investigadas.

Estabilidade e Estrutura do Complexo de Histocompatibilidade Maior do Morcego Classe I com β Heterologous2-Microglobulina

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Neste estudo, utilizamos o Bat MHC Classe I como modelo para resumir a metodologia e avaliar a viabilidade de uma classe I de MHC híbrida complexada com microglobulina beta-2 heterologous. Estudos anteriores mostraram que a substituição de mamíferos B2M não afeta significativamente a apresentação do peptídeo. Na verdade, o híbrido MHC Classe I pode ativar uma estrutura e função semelhantes à molécula original.Essas técnicas podem ser utilizadas para facilitar o estudo funcional e estruturado do MHC I para avaliação de resposta tecidual durante doenças infecciosas e imunoterapia tumoral. Para a transformação da cultura E.coli adicione 10 nanogramas de plasmídeo contendo morcego ou mhc humano classe I beta duas cadeias de hidrogênio microglobulina a 100 microliters de suspensão igualada e banhar a suspensão no gelo por 30 minutos. No final da incubação, o calor choca as bactérias por 90 segundos a 42 graus Celsius, e devolve a cultura ao banho de gelo por dois minutos.Em seguida, adicione 800 microliters de caldo de lysogeny à cultura, e agite a suspensão em uma plataforma de balanço por 20 minutos a 37 graus Celsius, e 200 rotações por minuto. No final da incubação, espalhe 100 microlitadores da bactéria em uma lâmina de cultura resistente a antibióticos apropriada. Na manhã seguinte, escolha um único clone bacteriano recentemente transformado e inocula o clone com três mililitros de LB com meio antibiótico.Coloque a cultura na plataforma de balanço a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Na manhã seguinte, transfira 500 microliters do estoque bacteriano ativado para 50 mililitros de LB com meio antibiótico, e devolva as bactérias para a incubadora de rochas durante a noite. Divida o estoque bacteriano ativado restante em 500 alíquotas de microliter e adicione cada alíquota a 500 volumes de microliter de 40% glicerol, para armazenamento de menos 80 graus Celsius.Para gerar grandes quantidades de proteína recombinante, na manhã seguinte transfira a suspensão bacteriana em dois litros de LB com meio antibiótico em uma proporção de um a 100, e devolva a cultura à incubadora de balanço até que uma absorção de 0,6 a 600 nanômetros seja alcançada. Em seguida, adicione um IPTG milimolar à cultura para induzir a expressão do gene trans. Após quatro a seis horas de indução, transfira a cultura bacteriana para garrafas para centrifugação, e suspenda as pelotas de células bacterianas em 60 mililitros de PBS por garrafa.Em seguida, libira a proteína recombinante expressa por disruptor de células ultrassônicas 99 vezes, por seis segundos e um intervalo de 12 segundos a 300 Watts por sônicação. Para inclusão, a purificação corporal recolhe as bactérias sonicadas por centrifugação e suspende as pelotas em um volume apropriado de tampão de lavagem para duas centrífugas adicionais. Após a segunda lavagem, suspenda os corpos de inclusão e o tampão de suspensão, e reserve uma alíquota de 20 microliteres da amostra para a página SDS para testar a pureza corporal de inclusão.Centrifugar a amostra restante e pesar o corpo de inclusão contendo pelotas. Adicione o tampão de dissolução às pelotas a uma concentração final de 30 miligramas de corpo de inclusão por mililitro de tampão. E use um agitador magnético para agitar lentamente a solução a quatro graus Celsius, até que os corpos de inclusão sejam dissolvidos no tampão de dissolução.Depois de descartar os precipitados, armazene os corpos de inclusão a menos 20 ou menos 80 graus Celsius. Para repatos complexos MHC, adicione uma glutationa reduzida de cinco milimoslar e glutationa oxidada de 0,5 milimolar a 250 a 300 mililitros, um tampão de ressarcimento de quatro graus Celsius. E mexa lentamente a solução em um agitador magnético a quatro graus Celsius por 10 a 20 minutos.Para a cadeia de hidrogênio MHC e beta duas diluições de microglobulina, carregue o corpo de inclusão em uma seringa de um mililitro e injete todo o volume de um mililitro da solução corporal de inclusão em um litro de tampão de recarregamento perto da barra de rebulação, para obter uma diluição rápida e eficiente. Em seguida, dissolver cinco miligramas por mililitro de peptídeo em sulfoxida de dimetila, e injetar rapidamente 200 microliters de peptídeo na solução de repato, como apenas demonstrado. Após 10 a 20 minutos de agitação lenta, injete três mililitros de corpos de inclusão da cadeia H em um novo volume de um litro de tampão de re dobra e permita que o redobramento prossiga em quatro graus Celsius por oito a 10 horas.Para determinar a concentração de proteína redobrada adicione o tampão de troca a uma câmara pressurizada com uma membrana oxidase multi cobre de 10 kilodalton, e concentre o buffer em volume de 30 a 50 mililitros. Transfira a solução de reabascamento para um tubo de centrífuga e remova os precipitados por centrifugação. Transfira cuidadosamente o supernato para a câmara e concentre ainda mais o buffer para um volume final de aproximadamente um mililitro.Remova os contaminantes finais por centrifugação e transfira o supernato para um tubo estéril. Use uma coluna de exclusão de tamanho de 10 300 GL para purificar as proteínas, coletando as amostras no pico e analisando-as usando a página SDS. Colete o pico complexo de MHC e concentre a proteína em uma concentração final de 15 miligramas por mililitro.Em seguida, diluir o complexo para 7,5 miligramas por concentração mililitro. Para realizar a cristalização do complexo MHC e peptídeo utilizando a técnica de difusão de vapor de gota sentada, adicione 0,8 microliters da amostra a uma placa de cristal comercial e selado a placa. Equilibre a solução amostral contra 100 microlitros de solução de reservatório a quatro ou 18 graus Celsius, e use um microscópio para observar regularmente o crescimento do cristal nos próximos seis meses.Para proteção criogênica, no final do experimento, transfira os cristais para uma solução de armazenamento contendo 20% de glicerol antes de esfriar rapidamente as amostras em um fluxo de nitrogênio gasoso Kelvin de 100 graus. Em seguida, colete dados de difração de raios-X de acordo com os protocolos padrão. Para determinar a estrutura dos complexos de cristal, abra os dados estruturais de difração de raios-X de alta resolução no programa Denzo dentro do pacote de software HK L 2000 e selecione um modelo inicial no banco de dados de proteínas.Para determinar a estrutura da proteína, abra os dados no Programa Phaser MR em CCP4 e utilize o modelo de raio-x refinado para o refinamento inicial da articulação. Em seguida, use o refino phoenix sozinho e modos articulares para o refinamento de raio-x sozinho, e o nêutron articular para o refinamento de raios-X. Após cada rodada de refinamento, verifique manualmente o modelo contra os mapas de densidade nuclear positivos do Fo-Fc e 2Fo-Fc em Coot.Nestes experimentos representativos, foram avaliadas as capacidades de ligação do vírus Hendra, o vírus Hendra One, para rebater as cadeias de hidrogênio CLASSE I do MHC com morcego homólogo beta dois microglobulina e beta humano heterologous duas microglobulina. Em ambas as análises, cristais com alta resolução foram formados através da renaturação com a cadeia de luz beta duas microglobulina. Na ausência de beta duas microglobulinas, esses complexos não se formam.Na cadeia de hidrogênio CLASSE I DO MHC Hendra Virus um, beta humano duas microglobulinas, resíduos conservados H31, D53, W60, e Y63 de beta humano duas microglobulina, que correspondem ao morcego beta duas microglobulina, fazem contato com a parte inferior do sulco de ligação de peptídeos e conservaram Q8, Y10, R12 e 24 resíduos, que correspondem aos dois microglobulinas beta ligados ao domínio alfa três. No morcego geral e nas estruturas humanas, a média de derivação quadrada média de resíduos de uma a 184 cadeias de hidrogênio é de 0,248 sob todas as superposições do átomo alfa de carbono, indicando que não há diferenças entre esses dois complexos. A estrutura do alinhamento do peptídeo mostra que as confirmações do Vírus Hendra um peptídeos nesses dois complexos são bastante semelhantes.O alinhamento da sequência também mostra que os aminoácidos de beta duas microglobulinas de diferentes espécies são altamente conservados. É importante oferecer aos complexos adversários uma alta eficiência de relatórios. Portanto, é crucial selecionar beta dois micro globulina adequados e usar corpos de inclusão altamente purificados.Este protocolo pode ser usado para obter complexo estável de MTC I através de potenciais substituições beta duas microglobulinas em outras espécies, e para existir são estrutura e função MTC I. Os dados obtidos a partir desses estudos podem ser usados para avaliar as respostas das células T durante doenças infecciosas e imunoterapias tumorais.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Indução e Avaliação de recombinação mudança de classe em purificada Células B murino

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Imunologia e Infecção

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Microondas Assistida Diagnóstico Rápido de Doenças vírus de planta por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Abordagem de processamento paralelo multi-alvo para Gene-a-estrutura Determinação da polimerase da gripe PB2 Subunidade

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Aplicação de consistente massagem-como perturbações em bezerros do mouse e monitoramento das mudanças de pressão intramuscular resultante

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Avaliando a expressão do complexo de histocompatibilidade maior classe I em neurônios hipocampais murinos primários por citometria de fluxo

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...