Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Это исследование было поддержано открытым фондом государственной ключевой лаборатории фармацевтической биотехнологии, Университет Нань-Цзин, Китай (Грант нет. KF-GN-201905), Национальный фонд естественных наук Китая (гранты 81971501). Уильям Лю поддерживается Отличной программой молодых ученых NSFC (81822040) и Пекинским новым звездным планом науки и техники (No181100006218080).

1. Подготовка выражений конструкций
<ol><li>Извлекаем последовательности генов класса I MHC (включая прогнозируемые гены) из базы данных NCBI.</li>
	<li>Извлечение более высоких последовательностей тяжелых цепей млекопитающих MHC I из базы данных иммуно полиморфизма (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) и базы данных U...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

Строительство гибридного белкового комплекса через гетерологичную замену из различных такс является общей стратегией для функциональных и структурных исследований, когда гомологичный комплекс недоступен, например, в MHC I и его лигандах. Вместе с тем существует ограниченное обобщение...

Основной комплекс гистосовместимости (MHC) существует у всех позвоночных и является набором генов, который определяет клеточный иммунитет к инфекционным патогенам. MHC класса I представляет эндогенные пептиды, такие как вирусные компоненты, вырабатываемые при вирусной инфекции, Т-клеточных рецепторов (TCR) на поверхностиCD8 и Т-клеток для окаймляют клеточный иммунитет и участвовать в иммуннойрегуляции 1. Структурное исследование MHC I связывания с пептидами предоставляет информацию о пептидных связывающих мотивов и особенностей представления молекул MHC I, который играет жизненно важную роль в оценкеCD8 и Т-клеток иммунной реакции и разработки вакцины.
С момента первой кристаллизации и структурного определения MHC I молекулярной Bjorkman et al.2, анализ кристаллической структурымолекул MHC I значительно способствовал пониманию того, как пептиды связываются с молекулами MHC I, и помогает понять взаимодействие световых цепей с тяжелыми цепями и пептидами. Серия последующих исследований показала, что, хотя гены, кодирующие световую цепь, не связаны с MHC, световая цепь является ключевым белком для сборки молекул MHC I3,4. Он взаимодействует с тремя областями молекул класса I MHC на нескольких поверхностях. Когда световая цепь отсутствует, молекулы класса I MHC не могут быть правильно выражены на поверхности антигеносующих клеток и не могут взаимодействовать с TCR для оказания своих иммунологических функций.
MHC I состоит из тяжелой цепи (H цепи) и световой цепи (т.е. β2-микроглобулин (β2 м))и собирается через привязку к подходящемупептиду 5. Внеклеточный сегмент цепочки H состоит из доменов No1, No2 и No36. Домены No1 и No2 образуют пептидную связывающую канавку (PBG). Цепочка β2 мвыступает в качестве структурного подразделения сборочного комплекса в MHC I, стабилизирующей конформацию комплекса, и является молекулярным сопровождаем для цепи MHC I H,складываемой 7,8,9. Серия исследований показала, что MHC I H цепи из различных млекопитающих, таких как летучая мышь (Хироптера) (Ptal-N-01:01)10, резус макаки (Приматы) (Маму -Би-17)11 (Маму-АЗ01)12 (Маму-АЗ02)13, мышь (Родентия) (H-2Kd)14,15, собака (Carnivora) (DLA-88'50801)16, крупный рогатый скот (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 и лошади (Перисodactyla) (Eqca-N-00602 и Eqca-N'00601)18 может сочетаться с гетерологическими β2 м(Таблица 1). Эти гибридные молекулы часто используются в структурных и функциональных исследованиях. Однако методология функционального и структурного исследования гибридного MHC I с гетерологическим β2 мпока не обобщена. Между тем, структурная основа для взаимозаменяемых βмеждуразличными таксами остается неясной.
В этом случае суммируются процедуры выражения MHC I, повторного сплещания, кристаллизации, сбора кристаллических данных и определения структуры. Кроме того, анализируются потенциальные замены β2 му различных видов путем сравнения структурной конформации MHC I, стабилизированной гомологичным и гетерологическим β2 м. Эти методы будут полезны для дальнейшего структурного исследования MHC I и CD8 иоценки иммунного ответа Т-клеток при раке и инфекционных заболеваниях.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

Основной комплекс гистосовместимости (MHC) играет ключевую роль в представлении пептида антигена и иммунных реакций Т-клеток против инфекционных заболеваний и развития опухоли. Гибрид MHC I, сложный с гетерологическим β 2-микроглобулин (β2 м)замена от различных видов может быть стабилизирована в пробирке. Это осуществимое средство для изучения MHC I млекопитающих, когда гомологичный β2 мнедоступен. Между тем, указывается, что β2 м заменане существенно влияет на пептидную презентацию. Тем не менее, существует ограниченное обобщение относительно методологии и технологии для гибридногоMHC I, сложного с гетерологическим β 2-микроглобулином (β2 м). В этом случае представлены методы оценки осуществимости β2 мзамены в исследовании MHC I. Эти методы включают подготовку конструкций выражения; очистка инклюзивных тел и повторное сложение комплекса МХК; определение термостабельности белка; кристаллический скрининг и определение структуры. Это исследование дает рекомендацию для понимания функции и структуры MHC I, а также имеет важное значение для оценки реакции Т-клеток во время инфекционных заболеваний и иммунотерапии опухоли.

Предыдущая работа сообщила, что геВ-производные HeV1 (DFANTFLP) пептид был представлен Ptal-N'01:0110,19. В этом случае была оценена связывающая способность этого пептида к Птал-НО01:01 с гомологичной летучей мышью β<font face="Helvetica Neue, Arial, sans-se...

Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Протокол описывает экспериментальные методы получения стабильного крупного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I через потенциальные β 2-микроглобулин (β2 м)замены различных видов. Исследовано структурное сравнение MHC I, стабилизированное гомологичным и β2 м.

Стабильность и структура Bat Major Histocompatibility Complex Class I с гетерологическим β2-Микроглобулин

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

В этом исследовании мы использовали Bat MHC класса I в качестве модели для обобщения методологии, а также для оценки осуществимости гибридного класса MHC I, сложного с гетерологическим бета-2 микроглобулином. Предыдущие исследования показали, что замена млекопитающего B2M не влияет на представление пептида. В самом деле, гибридный MHC класса Я могу активировать аналогичную структуру и функции оригинальной молекулы.Эти методы могут быть использованы для облегчения функционального и структурированного исследования MHC I для оценки реакции тканей во время инфекционных заболеваний и иммунотерапии опухоли. Для преобразования культуры E.coli добавьте 10 нанограммов плазмиды, содержащей летучую мышь или бета-версию MHC I класса I, к 100 микролитров выровненной подвески и искупайте подвеску во льду в течение 30 минут. В конце инкубации, тепловой удар бактерий в течение 90 секунд при температуре 42 градусов по Цельсию, и вернуть культуру в ледяную ванну в течение двух минут.Затем добавьте 800 микролитров лизогенного бульона в культуру и встряхните подвеску на платформе для качания в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и 200 вращениях в минуту. В конце инкубации, распространение 100 микролитров бактерий на соответствующие устойчивые к антибиотикам культуры лезвие. На следующее утро, выбрать один недавно преобразованный бактериальный клон и привить клон с тремя миллилитров LB с антибиотиком среды.Поместите культуру на платформу для качания при 37 градусах по Цельсию в течение 12-16 часов. На следующее утро перенесите 500 микролитров активированного бактериального запаса в 50 миллилитров LB с помощью антибиотиков и верните бактерии в инкубатор для качания на ночь. Разделите оставшийся активированный бактериальный запас на 500 микролитерных алицитов и добавьте каждую алициту к 500 объемам микролитров 40%глицерола, для хранения минус 80 градусов по Цельсию.Для генерации большого количества рекомбинантного белка, на следующее утро передать бактериальную суспензию в два литра LB с антибиотиком среды на один к 100 отношение, и вернуть культуру в сковка инкубатор до поглощения 0,6 на 600 нанометров достигается. Затем добавьте один миллимолярный IPTG в культуру, чтобы вызвать экспрессию транс-гена. После четырех-шести часов индукции, передача бактериальной культуры в бутылки для центрифугации, и повторно приостановить бактериальных гранул клеток в 60 миллилитров PBS на бутылку.Затем освободите выраженный рекомбинантный белок ультразвуковым разрушителем клеток 99 раз, в течение шести секунд и с интервалом 12 секунд при 300 ваттах на звуковое оконию. Для включения очистки организма собирают звуковые бактерии путем центрифугации и повторно приостанавливают гранулы в соответствующем объеме стирального буфера для двух дополнительных центрифуг. После второй стирки, повторно приостановить включение органов и повторной подвески буфера, и выделить 20 микролитер aliquot образца для страницы SDS для проверки чистоты тела включения.Центрифуга оставшийся образец, и весят включения тела, содержащего гранулы. Добавьте буфер растворения к гранулам к окончательной концентрации 30 миллиграммов тела включения на миллилитр буфера. И используйте магнитный мешалку, чтобы медленно перемешать раствор при четырех градусах по Цельсию, пока тела включения не растворяются в буфере растворения.После сброса осадков, хранить включения органов при минус 20 или минус 80 градусов по Цельсию. Для комплексного рефолсирования MHC добавьте пятимилимолярный глутатион и 0,5 миллимолярный окисляемый глутатион на 250-300 миллилитров, буфер повторного сплещения на четыре градуса Цельсия. И медленно перемешать раствор на магнитной мешалки при четырех градусах по Цельсию в течение 10 до 20 минут.Для MHC водородной цепи и бета два микроглобулина разбавления, загрузить включение тела в один миллилитр шприц и ввести весь один миллилитр объем включения тела раствор в один литр сверления буфера вблизи перемешать бар, чтобы получить быстрое и эффективное разбавление. Затем растворите пять миллиграммов на миллилитр пептида в диметилсульфоксиде и быстро ввилите 200 микролитров пептида в раствор для сверяния, как это было продемонстрировано. После 10 до 20 минут медленного перемешивания, введать три миллилитров H цепи включения органов в новый один литр объема повторного буфера и позволяют повторного продолжения при четырех градусах по Цельсию в течение восьми до 10 часов.Для определения сжатой концентрации белка добавьте буфер обмена в герметичную камеру с мембраной оксидазы 10 килодальтонов с много медью и сконцентрируйте буфер до 30-50 миллилитров объема. Перенесите раствор рефолсирования в центрифугу и удалите осадки центрифугой. Аккуратно перенесите супернат в камеру и далее сконцентрируйте буфер на конечный объем примерно в миллилитр.Удалите любые окончательные загрязняющие вещества путем центрифугации и перенесите супернят в стерильную трубку. Используйте десять трехсот столбец исключения размера GL для очистки белков, сбора образцов на пике и анализа их с помощью страницы SDS. Соберите пик комплекса MHC и сконцентрировать белок до конечной концентрации 15 миллиграммов на миллилитр.Затем разбавить комплекс до 7,5 миллиграммов на миллилитр концентрации. Для выполнения кристаллизации комплекса MHC и пептида с использованием метода диффузии паров сидя капли, добавьте 0,8 микролитров образца в коммерческую кристаллическую доску и запечатайте доску. Равноденствие образцового раствора против 100 микролитров раствора резервуара при 4 или 18 градусах цельсия, и используйте микроскоп, чтобы регулярно наблюдать рост кристалла в течение следующих шести месяцев.Для криогенной защиты, в конце эксперимента, перенесите кристаллы в раствор для хранения, содержащий 20%глицерол, прежде чем быстро охлаждать образцы в 100-градусном газозвуковой поток азота Кельвина. Затем соберите данные рентгеновской дифракции в соответствии со стандартными протоколами. Чтобы определить структуру кристаллических комплексов, откройте структурные данные о дифракции высокого разрешения в программе Denzo в рамках пакета программного обеспечения HK L 2000 и выберите начальную модель в банке данных о белках.Чтобы определить структуру белка, откройте данные в Phaser MR Program в CCP4 и используйте усовершенствованную рентгеновую модель для первоначального уточнения суставов. Затем используйте Феникс уточнить в одиночку и совместных режимов для рентгеновского самостоятельно уточнения, и совместный нейтрон для рентгеновского уточнения. После каждого раунда уточнения, вручную проверить модель против Fo-Fc, и 2Fo-Fc положительной ядерной плотности карты в Кут.В этих репрезентативных экспериментах были оценены связывающие способности вируса Хендра, полученные пептидом Hendra Virus One для водородной цепи типа MHC с гомологичной бета-версией летучих мышей двух микроглобулиных и гетерологических бета-версий человека двумя микроглобулинами. В обоих анализах кристаллы с высоким разрешением образовались в результате ренатурации с помощью бета-двух микроглобулиных световых цепочек. При отсутствии бета-двух микроглобулинов эти комплексы не образуются.В водородной цепи MHC класса I Hendra Virus one, человеческая бета-структура двух микроглобулинов, сохраненные остатки H31, D53, W60 и Y63 бета-версии человека два микроглобулина, которые соответствуют бета летучей мыши два микроглобулина, ввести контакт с нижней части пептида связывания паз и сохраняется No 8, Y10, R12, и 24 остатков, которые соответствуют бета-двух микроглобулинов связаны с альфа-три домена. В общей структуре летучих мышей и человека средний уровень происхождения остатков от 1 до 184 водородных цепей составляет 0,248 при всех суперпозициях атома альфа-углерода, что указывает на отсутствие различий между этими двумя комплексами. Структура выравнивания пептида показывает, что подтверждения вируса Хендра один пептиды в этих двух комплексах очень похожи.Выравнивание последовательности также показывает, что аминокислоты бета-двух микроглобулинов разных видов очень консервативны. Важно предлагать комплексы противника с высокой эффективностью отчетности. Поэтому крайне важно выбрать подходящую бета-версию двух микроглобулина и использовать высокоочищенные органы включения.Этот протокол может быть использован для получения стабильного комплекса MTC I через потенциальную бета-версию двух микроглобулиных замен у других видов, и для существования они являются структурой и функцией MTC I. Данные, полученные в ходе этих исследований, могут быть использованы для оценки реакции Т-клеток при инфекционных заболеваниях и иммунотерапии опухолей.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Индукция и оценка класса Рекомбинация коммутатор в Очищенная мышиные клетки B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Микроволновая печь Assisted экспресс-диагностики болезней растений Вирус помощью просвечивающей электронной микроскопии

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Многоцелевой параллельный подход для обработки Гена на элемент структуры Определение гриппа с использованием полимеразной PB2 субъединицы

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

В Ситу обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Эффективной и простой метод для установления линии Т-клеток у больных с хроническим активный вирус Эпштейна - Барр инфекции и НК

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic убийства Assay оценить иммунологические реакции против бактериальных патогенов

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Применение последовательных массаж-как Пертурбации на мышителях и мониторинг результирующих внутримышечных изменений давления

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Оценка экспрессии основных гистосовместимости комплекс класса I на первичном Murine гиппокампа нейронов потока цитометрии

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...