Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Este estudio fue apoyado por el fondo abierto del laboratorio clave estatal de Biotecnología Farmacéutica, Universidad Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 81971501). William J. Liu cuenta con el apoyo del Programa de Jóvenes Científicos Excelentes de la NSFC (81822040) y beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

1. Preparación de construcciones de expresión
<ol><li>Recuperar las secuencias de genes de clase I MHC (incluyendo genes predichos) de murciélagos de la base de datos NCBI.</li>
	<li>Recupere secuencias de cadena pesada MHC I de mamíferos superiores de la base de datos de inmuno polimorfismo (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) y la base de datos UniProt (www.uniprot.org).</li>
	<li>Para obtener complejos de MHC solubles, mutar las secuencias para eliminar las regiones citosólicas y transmembranas.</li>
	<li>Clonar los g...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

La construcción de un complejo proteico híbrido a través de la sustitución heterologosa de diferentes taxones es una estrategia común para las investigaciones funcionales y estructurales cuando el complejo homólogo no está disponible, como en el MHC I y sus ligandos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología. En este documento, se analizó la estructura del murciélago MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizado por bβ2m o hβ2m. Los aminoácidos clave ...

El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) existe en todos los vertebrados y es un conjunto de genes que determina la inmunidad mediada por células a patógenos infecciosos. MHC clase I presenta péptidos endógenos, tales como componentes virales producidos sobre la infección por virus, a los receptores de células T (TCR) en la superficie de las células CD8+ T para mediar la inmunidad celular y participar en la regulación inmune1. Un estudio estructural de la unión MHC I a péptidos proporciona información sobre motivos de unión de péptidos y características de presentación de moléculas MHC I, que desempeña un papel vital en la evaluación de las respuestas inmunes a células CD8+ T y el desarrollo de vacunas.
Desde la primera cristalización y determinación estructural del MHC I molecular por Bjorkman et al.2,el análisis de estructura cristalina de moléculas MHC I ha promovido en gran medida la comprensión de cómo los péptidos se unen a las moléculas MHC I, y ayuda a entender la interacción de cadenas ligeras con cadenas pesadas y péptidos. Una serie de estudios de seguimiento indicaron que aunque los genes que codifican la cadena de luz no están asociados con el MHC, la cadena de luz es una proteína clave para el montaje de moléculas MHC I3,4. Interactúa con los tres dominios de las moléculas de clase I de MHC en múltiples superficies. Cuando la cadena de luz está ausente, las moléculas MHC clase I no se pueden expresar correctamente en la superficie de las células que presentan antígenos y no pueden interactuar con TCR para ejercer sus funciones inmunológicas.
MHC I se compone de una cadena pesada (cadena H) y cadena de luz (es decir, β2-microglobulina (β2m)), y se ensambla a través de la unión a un péptido adecuado5. El segmento extracelular de la cadena H consta de α1, α2 y α3 dominios6. Los dominios α1 y α2 forman la ranura de unión de péptidos (PBG). La cadena βde 2m actúa como subunidad estructural del complejo de montaje en MHC I, estabilizando la conformación del complejo, y es una chaperona molecular para la cadena MHC I H plegable7,8,9. Una serie de estudios han demostrado que las cadenas MHC I H de varios mamíferos como murciélago (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10,rhesus macaque (Primates) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, ratón (Rodentia) (H-2Kd)14,15, perro (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, ganado (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 y equino (Periss (Eqca-N*00602 y Eqca-N*00601)18 puede combinarse con β heterologous2m (Tabla 1). Estas moléculas híbridas se utilizan a menudo en estudios estructurales y funcionales. Sin embargo, la metodología para el estudio funcional y estructural del MHC I híbrido con β heterologousde 2m aún no se resume. Mientras tanto, la base estructural para el intercambiado β2m entre diferentes taxones sigue sin estar clara.
En este documento, se resume el procedimiento para la expresión MHC I, la refolding, la cristalización, la recopilación de datos de cristal y la determinación de la estructura. Además, se analizan posibles sustituciones de β2m de diferentes especies comparando la conformación estructural del MHC I estabilizada por β2m. Estos métodos serán útiles para un mayor estudio estructural del MHC I y la evaluación de la respuesta inmune de células T CD8+ en cáncer y enfermedades infecciosas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) desempeña un papel fundamental en la presentación de péptidos de antígeno y las respuestas inmunes a las células T contra las enfermedades infecciosas y el desarrollo tumoral. El MHC híbrido I complejo con β heterologosa2-microglobulina (β2m) sustitución de diferentes especies se puede estabilizar in vitro. Este es un medio factible para estudiar MHC I de mamíferos, cuando el βhomónode 2 m no está disponible. Mientras tanto, se indica que la sustitución de mamíferos β2m no afecta significativamente la presentación de péptidos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología para el MHC I híbrido complejo con heterologous β2-microglobulina (β2m). En este documento, se presentan métodos para evaluar la viabilidad de la sustitución heterologosa βde 2m en el estudio MHC I. Estos métodos incluyen la preparación de construcciones de expresión; purificación de los organismos de inclusión y refolding del complejo MHC; determinación de la termosabilidad proteica; cribado de cristal y determinación de la estructura. Este estudio proporciona una recomendación para entender la función y estructura del MHC I, y también es significativo para la evaluación de la respuesta de las células T durante las enfermedades infecciosas y la inmunoterapia tumoral.

Trabajos anteriores informaron que el péptido HeV1 (DFANTFLP) derivado del HeV fue presentado por Ptal-N*01:0110,19. En este documento seevaluó la capacidad de unión de este péptido a Ptal-N*01:01 con murciélago homólogo β2m (bβ<sub...

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Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

El protocolo describe métodos experimentales para obtener sustitutos estables del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase I a través de posibles β sustituciones de2-microglobulina (β2m) de diferentes especies. Se investigó la comparación estructural del MHC I estabilizado por β2m homólogas y heterologosas.

Estabilidad y estructura de Murciélago Mayor Histocompatibilidad Complejo Clase I con Heterologous β2-Microglobulina

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

En este estudio, utilizamos Bat MHC Clase I como modelo para resumir la metodología, y para evaluar la viabilidad de un híbrido MHC clase I complejo con microglobulina beta-2 heterologosa. Estudios anteriores han demostrado que la sustitución B2M de mamíferos no afecta significativamente a la presentación del péptido. De hecho, el híbrido MHC Clase I puede activar una estructura y función similares a la molécula original.Estas técnicas se pueden utilizar para facilitar el estudio funcional y estructurado del MHC I para la evaluación de la respuesta a los tejidos durante enfermedades infecciosas e inmunoterapia tumoral. Para la transformación del cultivo de E.coli añadir 10 nanogramos de plásmido que contienen murciélago o humano MHC Clase I beta dos cadena de hidrógeno de microglobulina a 100 microlitros de suspensión igualada y bañar la suspensión en hielo durante 30 minutos. Al final de la incubación, el calor impacta las bacterias durante 90 segundos a 42 grados centígrados, y devuelve el cultivo al baño de hielo durante dos minutos.A continuación añadir 800 microlitros de caldo de lisógena a la cultura, y agitar la suspensión en una plataforma de balanceo durante 20 minutos a 37 grados Celsius, y 200 rotaciones por minuto. Al final de la incubación, esparce 100 microlitros de la bacteria en una hoja de cultivo adecuada resistente a los antibióticos. A la mañana siguiente, elija un solo clon bacteriano recientemente transformado e inocular el clon con tres mililitros de LB con medio antibiótico.Coloque la cultura en la plataforma de balanceo a 37 grados Celsius durante 12 a 16 horas. A la mañana siguiente, transfiera 500 microlitros del caldo bacteriano activado a 50 mililitros de LB con medio antibiótico, y devuelva la bacteria a la incubadora de rocas durante la noche. Divida el material bacteriano activado restante en 500 alícuotas de microlitro y agregue cada alícuota a 500 volúmenes de microlitro del 40% de glicerol, para menos 80 grados centígrados de almacenamiento.Para generar grandes cantidades de proteína recombinante, a la mañana siguiente transfiera la suspensión bacteriana a dos litros de LB con medio antibiótico a una proporción de uno a 100, y devuelva el cultivo a la incubadora de mecedoras hasta que se logre una absorbancia de 0,6 a 600 nanómetros. A continuación, agregue un IPTG mililitro al cultivo para inducir la expresión del gen trans. Después de cuatro a seis horas de inducción, transfiera el cultivo bacteriano a botellas para una centrifugación y vuelva a suspender los pellets celulares bacterianos en 60 mililitros de PBS por botella.A continuación, libere la proteína recombinante expresada por disruptor de células ultrasónicas 99 veces, durante seis segundos y un intervalo de 12 segundos a 300 vatios por sonicación. Para su inclusión, la purificación del cuerpo recoge las bacterias sonicadas mediante centrifugación y vuelve a suspender los pellets en un volumen adecuado de amortiguador de lavado para dos centrifugaciones adicionales. Después del segundo lavado, vuelva a suspender los cuerpos de inclusión y vuelva a suspender el búfer, y reserve un aliquot de 20 microlitros de la muestra para la página SDS para probar la pureza del cuerpo de inclusión.Centrífuga la muestra restante y sopese el cuerpo de inclusión que contiene pellets. Añadir búfer de disolución a los pellets a una concentración final de 30 miligramos de cuerpo de inclusión por mililitro de buffer. Y usa un agitador magnético para agitar lentamente la solución a cuatro grados centígrados, hasta que los cuerpos de inclusión se disuelvan en el búfer de disolución.Después de descartar los precipitados, guarde los cuerpos de inclusión a menos 20 o menos 80 grados Celsius. Para el reencuentro complejo MHC, agregue cinco mililitros de glutatión reducido y 0,5 mililitros de glutatión oxidado a 250 a 300 mililitros, un amortiguador de refolding de cuatro grados Celsius. Y revuelva lentamente la solución en un agitador magnético a cuatro grados Celsius durante 10 a 20 minutos.Para la cadena de hidrógeno MHC y la dilución beta de dos microglobulinas, cargue el cuerpo de inclusión en una jeringa de un mililitro e inyecte todo el volumen de un mililitro de solución corporal de inclusión en un litro de búfer de refoldado cerca de la barra de agitación, para obtener una dilución rápida y eficiente. A continuación, disolver cinco miligramos por mililitro de péptido en sulfóxido de dimetil, e inyectar rápidamente 200 microlitros de péptido en la solución de redil como se acaba de demostrar. Después de 10 a 20 minutos de agitación lenta, inyecte tres mililitros de cuerpos de inclusión en cadena H en un nuevo volumen de un litro de búfer de reencuacamiento y permita que el refolding continúe a cuatro grados Celsius durante ocho a 10 horas.Para determinar la concentración de proteínas refolded añadir búfer de intercambio a una cámara presurizada con una membrana oxidasa multi cobre de 10 kilodalton, y concentrar el amortiguador a 30 a 50 mililitros de volumen. Transfiera la solución de reenfoque a un tubo centrífugo y retire los precipitados por centrifugación. Transfiera cuidadosamente el supernato a la cámara y concentre aún más el búfer a un volumen final de aproximadamente un mililitro.Retire los contaminantes finales por centrifugación y transfiera el supernato a un tubo estéril. Utilice una columna de exclusión de tamaño de diez trescientos GL para purificar las proteínas, recogiendo las muestras en el pico y analizándolas utilizando la página SDS. Recoge el pico complejo MHC y concentra la proteína a una concentración final de 15 miligramos por mililitro.A continuación, diluya el complejo a 7,5 miligramos por concentración de mililitro. Para realizar la cristalización del complejo MHC y péptido utilizando la técnica de difusión de vapor de caída sentado, agregue 0,8 microlitros de la muestra a una placa de cristal comercial y selle la placa. Eequilibrar la solución de muestra contra 100 microlitros de solución de reservorio a cuatro o 18 grados Celsius, y utilizar un microscopio para observar regularmente el crecimiento del cristal durante los próximos seis meses.Para la protección criogénica, al final del experimento, transfiera los cristales a una solución de almacenamiento que contenga un 20% de glicerol antes de enfriar rápidamente las muestras en una corriente de nitrógeno gaseoso Kelvin de 100 grados. A continuación, recopile datos de difracción de rayos X de acuerdo con los protocolos estándar. Para determinar la estructura de los complejos cristalinos, abra los datos estructurales de difracción de rayos X de alta resolución en el programa Denzo dentro del paquete de software HK L 2000 y seleccione un modelo inicial en el banco de datos de proteínas.Para determinar la estructura de la proteína, abra los datos en el Programa de MR Phaser en CCP4 y utilice el modelo de rayos X refinado para el refinamiento de juntas inicial. A continuación, utilice los modos de refinamiento de Phoenix solo y articulaciones para el refinamiento solo de rayos X, y el neutrones articular para el refinamiento de rayos X. Después de cada ronda de refinamiento, compruebe manualmente el modelo contra el Fo-Fc, y mapas de densidad nuclear positiva 2Fo-Fc en Coot.En estos experimentos representativos, se evaluaron las capacidades de unión del virus Hendra derivado del péptido Hendra Virus One para batear cadenas de hidrógeno MHC Clase I con murciélago homologoso beta dos microglobulina y betaglobulina humana heterologosa dos microglobulina. En ambos análisis, se formaron cristales con una alta resolución mediante la reaturación con la cadena de luz beta de dos microglobulinas. En ausencia de beta dos microglobulina, estos complejos no se forman.En la cadena de hidrógeno MHC Clase I Hendra Virus uno, estructura beta dos de microglobulina humana, residuos conservados H31, D53, W60 y Y63 de microglobulina beta dos humana, que corresponden a microglobulina beta dos murciélagos, hacen contacto con la parte inferior de la ranura de unión de péptidos y conservan Q8, Y10, R12 y 24 residuos, que corresponden a las dos microglobulinas beta vinculadas al dominio alfa tres. En las estructuras generales de murciélagos y humanos, la derivación cuadrada media de la raíz media de residuos de una a 184 de las cadenas de hidrógeno es de 0,248 bajo todas las superposiciones del átomo alfa de carbono, lo que indica que no hay diferencias entre estos dos complejos. La estructura de la alineación de péptidos muestra que las confirmaciones de Hendra Virus un péptido en estos dos complejos son bastante similares.La alineación de secuencias también muestra que los aminoácidos de la microglobulina beta dos de diferentes especies están altamente conservados. Es importante ofrecer a los complejos adversarios una alta eficiencia en la presentación de informes. Por lo tanto, es crucial seleccionar beta dos micro globulina adecuada y utilizar cuerpos de inclusión altamente purificados.Este protocolo se puede utilizar para obtener complejo MTC I estable a través de posibles sustituciones beta de dos microglobulinas en otras especies, y para existir son estructura y función MTC I. Los datos obtenidos de estos estudios se pueden utilizar para evaluar las respuestas de las células T durante enfermedades infecciosas e inmunoterapias tumorales.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Asistida por microondas diagnóstico rápido de enfermedades de virus de plantas por microscopía electrónica de transmisión

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Multi-objetivo enfoque de procesamiento paralelo para Gene a la estructura de determinación de la polimerasa subunidad PB2 Influenza

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Aplicación de Perturbaciones Consistentes Similares al Masaje en Los terneros de ratón y Monitoreo de los Cambios de Presión Intramuscular Resultantes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Evaluación De La Expresión Del Complejo De Histocompatibilidad Mayor Clase I En Las Neuronas Primarias Murinas Del Hipocampo Por Citometría De Flujo

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...