Name: stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Denna studie stöddes av den öppna fonden för det statliga nyckellaboratoriet för farmaceutisk bioteknik, Nan-jing University, Kina (Anslag nr. KF-GN-201905), Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (bidrag 81971501). William J. Liu stöds av NSFC:s utmärkta unga vetenskapsprogram (81822040) och Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

1. Förberedelse av uttryckskonstruktioner
<ol><li>Hämta sekvenserna av MHC-klass I-gener (inklusive förutsagda gener) från fladdermöss från NCBI-databasen.</li>
	<li>Hämta högre däggdjur MHC I tunga kedjesekvenser från Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) och UniProt-databasen (www.uniprot.org).</li>
	<li>För att få lösliga MHC-komplex, mutagenisera sekvenserna för att ta bort cytosoliska och transmembrane regioner.</li>
	<li>Klona generna som kodar för ectodomains av fladdermusen P...

<ol>
	<li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation.">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li><li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen,+HLA-A2.">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li><li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene.">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li><li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8++cytolytic+T+cells.">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li><li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha(alpha)+and+HLA-A2.">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li><li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules.">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li><li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin.">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li><li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture.">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li><li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells.">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats.">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B*17:+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus.">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I:+crystal+structures+of+Mamu-A*01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape.">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A*02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus.">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li><li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8++T+cell+epitopes+and+host+MHC.">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li><li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif.">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88*50801:+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I.">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N*01801:+a+host+strategy+to+present+featured+peptides.">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles.">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li><li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule.">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A*0301+and+HLA-A*1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes.">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li><li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCpan,+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans.">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li><li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta++FlexPepDock+ab-initio:+simultaneous+folding,+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors.">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+two+H-2Db/glycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity.">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li><li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig.">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).</li><li>McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox.">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses.">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic.">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250 (2019).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CLUSTAL_X+windows+interface:+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools.">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li><li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESPript/ENDscript:+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins.">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li></ol>

Byggandet av ett hybridproteinkomplex genom heterolog substitution från olika taxa är en gemensam strategi för funktionella och strukturella undersökningar när det homologa komplexet inte är tillgängligt, till exempel i MHC I och dess ligands. Det finns dock begränsad summering av metoden och tekniken. Herein, strukturen av fladdermus MHC I, Ptal-N * 01: 01, stabiliseras av bβ2m eller hβ2m analyserades. De viktigaste aminosyrorna i β2m bindning till Ptal-N *01:01 konstaterades ...

Det stora histokompatibilitetskomplexet (MHC) finns i alla ryggradsdjur och är en uppsättning gener som bestämmer den cellmedierade immuniteten mot infektiösa patogener. MHC klass I presenterar endogena peptider, såsom viruskomponenter som produceras vid virusinfektion, till T-cellsreceptorer (TCR) på ytan av CD8+ T-celler för att medla cellulär immunitet och delta i immunreglering1. En strukturell studie av MHC I som binder till peptider ger information om peptidbindningsmotiv och presentationsfunktioner av MHC I-molekyler, som spelar viktiga roller vid utvärdering av CD8+ T-cellsimmunsvar och vaccinutveckling.
Sedan den första kristalliseringen och strukturella bestämningen av MHC I molekylär av Björkman et al.2, kristallstrukturanalysen av MHC I molekyler har kraftigt främjat förståelsen av hur peptider binder till MHC I molekyler, och hjälper till att förstå interaktionen mellan lätta kedjor med tunga kedjor och peptider. En serie uppföljande studier visade att även om generna som kodar för ljuskedjan inte är associerade med MHC, är ljuskedjan ett nyckelprotein för montering av MHCI-molekyler 3,4. Det interagerar med de tre domänerna i MHC klass I molekyler på flera ytor. När ljuskedjan är frånvarande kan MHC-molekyler av klass I inte uttryckas korrekt på ytan av antigen-presenterande celler och kan inte interagera med TCR för att utöva sina immunologiska funktioner.
MHC I består av en tung kedja (H-kedja) och ljuskedja (dvs. β2-mikroglobulin(β2m)) och monteras genom bindning till en lämplig peptid5. Det extracellulära segmentet i H-kedjan består av α1-, α2- och α3-domäner6. Domänerna α1 och α2 bildar peptidbindningsspåret (PBG). Den β 2 mkedjanfungerar som en strukturell underavdelning av monteringskomplexet i MHC I, stabiliserar konformationen av komplexet och är ett molekylärt förkläde för MHC I H-kedjevikning7,8,9. En serie studier har visat att MHC I H kedjor från olika däggdjur såsom fladdermus (Chiroptera) (Ptal-N *01:01)10, rhesus makaker (Primater) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mus (Rodentia) (H-2Kd) 14,1415, hund (Carnivora) (DLA-88*50801)16, nötkreatur (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 och häst (Peris (Eqca-N*00602 och Eqca-N*00601)18 kan kombineras med heterologt β2m(tabell 1). Dessa hybridmolekyler används ofta i strukturella och funktionella studier. Metoden för funktionell och strukturell studie av hybrid MHC I med heterologa β2m är dock ännu inte sammanfattad. Samtidigt är den strukturella grunden för den utbytta β2m mellan olika taxa fortfarande oklar.
Häri sammanfattas proceduren för MHC I uttryck, om dukning, kristallisering, kristall data insamling och struktur bestämning. Dessutom analyseras potentiella substitutioner av β2m från olika arter genom att jämföra den strukturella konformationen av MHC I stabiliseras av homologa och heterologa β2m. Dessa metoder kommer att vara till hjälp för ytterligare MHC I strukturstudie och CD8+ T cell immunsvar utvärdering i cancer och infektionssjukdomar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa MMCO membrane</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>A3291-500ml*5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215;Protein SDS Loading</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>PM099-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td>
			<td>Merck millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-9314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) strain</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>CB105-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>MP</td>
			<td>219605580</td>
			<td>Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1070</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-2Na</td>
			<td>KeyGEN BioTECH</td>
			<td>KGT515500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>HUSHI</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0399-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSSG</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0524-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E424-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h&#946;2m</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Inalco</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine Hydrochloride</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0877-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Boao Rui Jing</td>
			<td>A112130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17919</td>
			<td>Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioruler</td>
			<td>RH30056-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stability and structure of bat major histocompatibility complex class i with heterologous &beta;2-microglobulin

Det stora histokompatibilitet komplexa (MHC) spelar en central roll i antigen peptid presentation och T cell immun svar mot infektionssjukdomar och tumör utveckling. Hybrid MHC I komplex med heterologa β2-mikroglobulin(β2m) ersättning från olika arter kan stabiliseras in vitro. Detta är ett genomförbart sätt att studera MHC I av däggdjur, när den homologa β2m inte är tillgänglig. Samtidigt anges att däggdjurs β2m substitution inte signifikant påverkar peptidpresentationen. Det finns dock begränsad summering av metoden och tekniken för hybrid MHC I komplex med heterologt β2-mikroglobulin (β2m). Häri presenteras metoder för att utvärdera genomförbarheten av β2m substitution i MHC I studie. Dessa metoder inkluderar förberedelse av uttryckskonstruktioner; Rening av inklusionsorgan och omdubblning av MHC-komplexet. Bestämning av proteintermostabilitet. kristallscreening och strukturbestämning. Denna studie ger en rekommendation för att förstå funktion och struktur av MHC I, och är också signifikant för T-cells svar utvärdering under infektionssjukdomar och tumör immunterapi.

Tidigare arbete rapporterade att HeV-härledda HeV1 (DFANTFLP) peptiden presenterades av Ptal-N * 01: 0110,19. Häri utvärderades bindningskapaciteten hos denna peptid till Ptal-N*01:01 med homolog fladdermus β2m (bβ2<font fac...

Watch this Scientific Journal Video about Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃŽÂ²2-Microglobulin at JoVE.com

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous ÃƒÅ½Ã‚Â²2-Microglobulin

Protokollet beskriver experimentella metoder för att erhålla stabila stora histocompatibility komplexa (MHC) klass I genom potentiella β2-mikroglobulin(β2m) substitutioner från olika arter. Den strukturella jämförelsen av MHC jag stabiliseras av homologa och heterologa β2m undersöktes.

Stabilitet och struktur av Fladdermus Major Histocompatibility Complex Klass I med heterologous β2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

I denna studie använde vi Bat MHC Klass I som modell för att sammanfatta metodiken och för att utvärdera genomförbarheten av en hybrid MHC klass I komplex med heterologt beta-2 mikroglobulin. Tidigare studier har visat att däggdjurs B2M-substitutionen inte påverkar peptidpresentationen nämnvärt. Faktum är att hybrid MHC klass I kan aktivera en liknande struktur och funktion som den ursprungliga molekylen.Dessa tekniker kan användas för att underlätta funktionell och strukturerad studie av MHC I för vävnad svar utvärdering under infektionssjukdomar och tumör immunterapi. För E.coli-odlingstransformation tillsätt 10 nanogram plasmid innehållande fladdermus eller human MHC klass I beta två mikroglobulin vätekedja till 100 mikroliter utjämnad suspension och bada suspensionen i is i 30 minuter. I slutet av inkubationen chockar värmen bakterierna i 90 sekunder vid 42 grader Celsius och återvänder kulturen till isbadet i två minuter.Lägg sedan till 800 mikroliter lysogen buljong till kulturen och skaka suspensionen på en gungplattform i 20 minuter vid 37 grader Celsius och 200 rotationer per minut. I slutet av inkubationen, sprid 100 mikroliter av bakterierna på ett lämpligt antibiotikaresistent odlingsblad. Nästa morgon, välj en enda nyligen omvandlad bakterieklon och inokulera klonen med tre milliliter LB med antibiotikum medium.Placera kulturen på gungplattformen på 37 grader Celsius i 12 till 16 timmar. Nästa morgon överför du 500 mikroliter av det aktiverade bakteriebeståndet till 50 milliliter LB med antibiotikamedium och returnerar bakterierna till den gungande inkubatorn över natten. Dela upp det återstående aktiverade bakteriebeståndet i 500 mikroliter alikvoter och tillsätt varje alikvot till 500 mikrolitervolymer på 40% glycerol, för minus 80 grader Celsius lagring.För att generera stora mängder rekombinant protein överför nästa morgon bakteriesuspensionen till två liter LB med antibiotikummedium vid ett förhållande på 1 till 100 och återgår kulturen till den gungande inkubatorn tills en absorbans på 0,6 vid 600 nanometer uppnås. Lägg sedan till en millimolär IPTG till kulturen för att inducera uttryck av transgenen. Efter fyra till sex timmars induktion överför du bakteriekulturen till flaskor för centrifugering och suspenderar bakteriecellspellets i 60 milliliter PBS per flaska.Frigör sedan det uttryckta rekombinanta proteinet med ultraljud cell disruptor 99 gånger, i sex sekunder och ett intervall på 12 sekunder vid 300 Watt per ultraljudsbehandling. För införande av kroppsrening samla de sonifierade bakterierna genom centrifugering och suspendera pelletsen i en lämplig volym tvättbuffert för ytterligare två centrifugationer. Efter den andra tvätten, suspendera upp införandeorganen och återupphängningsbufferten och avsätt ett 20 mikroliter alikvot av provet för SDS-sidan för att testa inneslutningskroppens renhet.Centrifugera det återstående provet och väg in den inneslutningskropp som innehåller pellets. Tillsätt upplösningsbufferten till pelletsen till en slutlig koncentration av 30 milligram inklusionskropp per milliliter buffert. Och använd en magnetisk omrörare för att långsamt röra lösningen vid fyra grader Celsius, tills inklusionskropparna löses upp i upplösningsbufferten.Efter att ha kasserat fällningarna, lagra inkluderingskropparna på minus 20 eller minus 80 grader Celsius. För MHC-komplex omformning, tillsätt en fem millimolär reducerad glutation och 0,5 millimolar oxiderad glutation vid 250 till 300 milliliter, en fyra grader Celsius omdubblningsbuffert. Och rör långsamt lösningen på en magnetisk omrörare vid fyra grader Celsius i 10 till 20 minuter.För MHC vätekedja och beta två mikroglobulin utspädning, ladda inneslutningskroppen i en milliliter spruta och injicera hela en milliliter volym av införande kroppslösning i en liter omformningsbuffert nära omrörningsstången, för att få en snabb och effektiv utspädning. Lös sedan upp fem milligram per milliliter peptid i dimetylsulfoxid och injicera snabbt 200 mikroliter peptid i refoldinglösningen som just visats. Efter 10 till 20 minuters långsam omrörning, injicera tre milliliter H-kedjeinkluderingskroppar i en ny en liters volym omdubblningsbuffert och låt omdubblningen fortsätta vid fyra grader Celsius i åtta till tio timmar.För att bestämma den omveckade proteinkoncentrationen tillsätt utbytesbuffert till en tryckkammare med ett 10 kilodalton multikoppsoxidasmembran och koncentrera bufferten till 30 till 50 milliliter volym. Överför omdubblningslösningen till ett centrifugrör och ta bort fällorna genom centrifugering. Överför försiktigt supernaten i kammaren och koncentrera bufferten ytterligare till en slutlig volym på cirka en milliliter.Avlägsna eventuella slutliga föroreningar genom centrifugering och överför supernaten till ett sterilt rör. Använd en kolonn med 1030 GL-storlek för att rena proteinerna, samla in proverna på toppen och analysera dem med hjälp av SDS-sidan. Samla MHC komplexa topp och koncentrera proteinet till en slutlig koncentration av 15 milligram per milliliter.Späd sedan komplexet till 7,5 milligram per milliliter koncentration. För att utföra kristallisering av den komplexa MHC och peptiden med hjälp av tekniken för att sprida sittande droppånga, tillsätt 0,8 mikroliter av provet till en kommersiell kristallbräda och försegla brädan. Balansera provlösningen mot 100 mikroliter reservoarlösning vid fyra eller 18 grader Celsius och använd ett mikroskop för att regelbundet observera kristalltillväxten under de kommande sex månaderna.För kryogent skydd, i slutet av experimentet, överför kristallerna till en lagringslösning som innehåller 20% glycerol innan de snabbt kyler proverna i en 100 graders Kelvin gasformig kväveström. Samla sedan in röntgendiffraktionsdata enligt standardprotokoll. För att bestämma kristallkomplexens struktur öppnar du högupplösta strukturella röntgendiffraktionsdata i Denzo-programmet i HK L 2000-programvarupaketet och väljer en första modell i proteindatabanken.För att bestämma proteinstrukturen, öppna data i Phaser MR-programmet i CCP4 och använd den förfinade röntgenmodellen för den första gemensamma förfiningen. Använd sedan Phoenix-förfining ensam och foglägen för enbart röntgenförfining och den gemensamma neutronen för röntgenförfiningen. Efter varje omgång av förfining, kontrollera manuellt modellen mot Fo-Fc och 2Fo-Fc positiva kärntäthetskartor i Coot.I dessa representativa experiment, bindande kapaciteter av Hendra Virus härledda Hendra Virus One peptid att slå MHC klass I väte kedjor med homolog fladdermus beta två mikroglobulin och heterologa mänskliga beta två mikroglobulin utvärderades. I båda analys bildades kristaller med hög upplösning genom renaturation med beta två microglobulin ljus kedjan. I avsaknad av beta två mikroglobulin bildas inte dessa komplex.I MHC klass I vätekedjan Hendra Virus ett, Human beta två mikroglobulin struktur, bevarade rester H31, D53, W60 och Y63 av human beta två mikroglobulin, som motsvarar bat beta två mikroglobulin, ta kontakt med botten av peptid bindande spår och bevarade Q8, Y10, R12 och 24 rester, som motsvarar beta två mikroglobuliner bundna till alpha tre domänen. I de övergripande fladdermus- och mänskliga strukturerna är den genomsnittliga rotmedelvärdet kvadratisk härledning av rester en till 184 av vätekedjorna 0,248 under alla kol alfaatomens superpositioner, vilket indikerar att det inte finns några skillnader mellan dessa två komplex. Strukturen av peptid justering visar att bekräftelserna av Hendra Virus en peptider i dessa två komplex är ganska lika.Sekvensjustering visar också att aminosyrorna i beta två mikroglobulin från olika arter är mycket bevarade. Det är viktigt att erbjuda motståndarekomplexen en hög rapporteringseffektivitet. Därför är det viktigt att välja lämplig beta två mikroglobulin och att använda mycket renade inneslutningskroppar.Detta protokoll kan användas för att erhålla stabil MTC I-komplex genom potentiella beta två mikroglobulin substitutioner i andra arter, och att existera de är MTC I struktur och funktion. De data som erhålls från dessa studier kan användas för att bedöma T-cellssvar under infektionssjukdomar och tumörimmunterapier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induktion och Bedömning av klass Switch rekombination i Renad mus B-celler

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Mikrovågsassisterad snabb diagnos av växtsjukdomar virus genom transmissionselektronmikroskopi

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Multi-mål Parallel Processing Approach för Gene-till-struktur Fastställande av influensa polymeras PB2 Subenhet

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live avbildning av T-cellsignalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Upptäckt av autoreaktiva CD4 T-celler i hjärna och hjärta Använda MHC klass II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv och enkel metod för att fastställa NK och T cellinjer från patienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfektion

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Lägre dödande Assay att bedöma immunologiska reaktion mot bakteriella patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Tillämpning av konsekvent massage-liknande Perturbations på mus kalvar och övervaka de resulterande intramuskulärt tryckförändringar

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Bedömning av uttrycket av ha som huvudämne histocompatibilitykomplex klass I på primära Murine Hippocampal neuroner vid Flöde cytometri

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...