Name: analysis of human natural killer cell metabolism
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism at JoVE.com

저자들은 마이클 N. 삭 박사(국립 심장, 폐 및 혈액 연구소)에게 지원과 토론을 해 주셔서 감사합니다. 이 연구는 건강의 국가 학회, 국립 암 연구소 및 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. JT는 미킨(스페인)의 라몬 이 카잘 프로그램(교부라이C2018-026050-I)의 지원을 받고 있습니다.

모든 실험은 헬싱키의 의학 연구의 윤리적 원칙 선언에 따라 수행되었다. 기증자로부터 말초 혈액 샘플은 환자 서면 통보 동의와 함께 99-CC-0168 IRB 승인 프로토콜에 따라 수혈 의학의 NIH 부에서 얻어졌다.
1. 시약 준비
<ol><li>
NK 셀의 분리를 위한 시약 참고: 세포 배양 후드에서 이러한 시약을 준비합니다.<ol>
<li>NK 분리 버퍼 준비: 1mM EDTA와 2% 태아 송아지 혈청(FCS...

<ol>
	<li>Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+natural+killer+cell+responses:+integration+of+signals+for+activation+and+inhibition.">Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition.</a> Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).</li><li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells.">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li><li>Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. 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이 논문에서, 우리는 말초 혈액에서 순수하고 실행 가능한 1 차적인 인간 NK 세포를 효율적으로 격리하고 배양하기위한 프로토콜을 설립했습니다. 우리는 또한 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 산소 소비율 및 세포외 산성화 율에 의해 평가된 이들 NK 세포의 대사 활성 측정을 위한 조건을 최적화했습니다. 다른 호흡 측정 방법에 비해 세포 외 플럭스 분석기는 빠르며 소수의 세포가 필요하며 높?...

천연 킬러 (NK) 세포는 항 종양 및 항 바이러스 반응을 중재하는 선천성 림프구입니다. NK 세포는 인간 말초 혈액에 있는 모든 림프구의 5-15%를 포함하고, 또한 비장, 간, 골수 및 림프절에서 찾아볼 수 있습니다. NK 세포는 T 세포 수용체(TCR) 또는 B-세포 수용체(BCR)와 같은 다형성 클로노티픽 수용체를 발현하지 않는다. 대조적으로, 그들의 세포분석 기능의 활성화는 표적 세포1의표면에 불변의 리간드를 인식하는 수용체의 참여에 의해 자극된다1,2.
말초 혈액에서 분리 된 인간의 NK 세포를 휴식 인간 혈 청으로 보충 하는 배양 배지에서 며칠 동안 살아남을 수 있습니다. IL-15 또는 IL-2와 같은 사이토카인에 의한 NK 세포의 활성화는 세포를 증식하고 그들의 살상 능력의 증가로 유도하며, 다른 효과 들사이에서3,,4,,5. 몇몇 연구 결과는 그들의 신진 대사 활동에 있는 NK 세포 활성화 그리고 변경 사이 직접적인 상관관계를 보여주었습니다6. 이러한 신진 대사 변화는 에너지와 생합성의 관점에서 세포의 특정 요구 사항을 충족 하도록 운명.
호기성 세포와 유기체는 탄수화물, 지방 및 단백질의 이화작용 및 산화를 수반하는 일련의 화학 반응을 통해 에너지를 얻습니다. 글리코리시스, 트리카박실산(TCA) 주기 및 산화 인산화의 조합을 통해, 진핵세포는 ATP 수요의 대부분을 충족하고 세포 성장 및 증식에 필수적인 거대 분자를 위한 빌딩 블록으로 요구되는 중간체를 얻습니다. 글리코리시스(도1A)의공정은 세포내 포도당의 진입로 시작한다. 시토솔에서 포도당은 인산화되어 피루바테(포도당 분자당 ATP 분자 2분자의 순 생산)로 변형되어 젖산으로 감소하거나 미토콘드리아로 이송하여 아세틸-코아로 변형하여 TCA 주기를 입력합니다. TCA 주기는 아세틸-CoA의 더 많은 분자로 연료를 공급하고 CO2를 생성합니다 (결국 세포 외부에서 확산되고, 매체에서 H2O와 반응함으로써, 매체의 산성화로 이어질 탄산산을 생성합니다) 및 NADH, 전자 수송 체인 (ETC)에 전자를 기증하는 분자. 전자는 다른 단백질 복합체를 통해 여행하고 마지막으로 산소에 의해 허용됩니다. 이러한 복합체(I, III 및 IV)는 미토콘드리아 매트릭스에서 막 간 공간으로 H+를 펌핑합니다. 생성된 전기화학적 그라데이션의 결과로 H+는 복잡한 V(ATP-synthase)를 통해 매트릭스에 다시 입력하여 ATP 생성에 축적된 잠재적 에너지를 투자합니다.
글리코리시스와 미토콘드리아 호흡은 억제제를 사용하여 다른 지점에서 차단될 수 있다. 이러한 억제제의 지식과 사용은 세포외 플럭스 분석의 개발을 위한 기초였다. pH 및 산소와 같은 두 가지 간단한 파라미터를 실시간으로 측정함으로써 세포외 플럭스 분석기는 96웰 플레이트에서 글리코리시스 및 미토콘드리아 호흡의 속도를 유추합니다. 글리코리시스 스트레스 시험은 포도당 없이 기저 배지에서 수행된다(도1B)7. 세포외 산성화속도(ECAR)의 첫 번째 측정은 글리코리시스 독립적인 산성화를 나타낸다. 이전에 설명한 바와 같이 배지에서 H2 O와 결합하여 H +(TCA-연결된 ECAR)를 생성하는 TCA에 의해+ 생성된 CO2와 비혈당산성화라고 합니다.2 첫 번째 주사는 포도당 활용을 유도 하 고 글리코 리 시 증을 향상 하는 포도 당이다. 두 번째 주사는 두 로테네톤을 결합, 복합 I 억제제, 및 항마이신 A, 복합 III 억제제, ETC. 세포가 세포 ATP 수준을 유지하기 위해 글리코분해를 활성화하여 미토콘드리아 ATP 생산의 이러한 극적인 감소에 반응하는 것을 차단하고, 이는 기저 상태의 세포에 의해 사용되지 않지만 ATP 수요증가에 대응하여 잠재적으로 모집될 수 있는 글리코리시스의 양을 나타낸다. 세 번째 주사는 포도당 아날로그 2-Deoxyglucose (DG), 효소 헥소키나아제에 대 한 기판으로 포도당과 경쟁. 이 인산화의 생성물, 2-deoxyglucose-6-인산염은 피루바테로 변환될 수 없고, 따라서 글리코리시스가 막혀 ECAR를 최소한으로 낮춥습니다. 이 시점에서 측정된 ECAR에는 글리코리시스 또는 호흡기 활성뿐만 아니라 2-DG(Post 2-DG 산성화)에 의해 완전히 억제되지 않은 잔류 당화에 기인하지 않는 세포외 산성화의 다른 공급원을 포함한다.
미토콘드리아 스트레스 시험은 포도당(도1C)8을가진 배지에서 수행됩니다. 산소 소비속도(OCR)의 첫 번째 측정은 미토콘드리아 호흡(기저 호흡)의 기저선에 대응한다. 첫 번째 주사는 ATP 신타제(복합 V)를 통해 양성자의 반환을 억제하는 올리고마이신으로, ATP 합성을 차단하여 미토콘드리아 멤브레인을 급속히 극화하여 호흡기 복합체를 통해 추가 양성자가 펌핑되는 것을 방지하고 OCR의 감소로 이어집니다. 기준선 호흡과 올리고마이신을 첨가하여 주어진 값 간의 비교는 ATP 연결 호흡을 나타낸다. 산소 소비의 나머지 올리고마이신 무감각 비율은 양성자 누출이라고 하며, 이는 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이스9와같은 내부 미토콘드리아 막내지질 이중층 또는 단백질을 통한 양성자의 흐름을 나타낸다. 두 번째 주사는 미토콘드리아 막의 탈극화및 미토콘드리아 ATP 합성의 중단으로 이어지는 미토콘드리아 매트릭스에 H+의 대규모 진입을 유도하는 비커플러 2,4-디니트로페놀(DNP)이다. 세포는 막 전위(최대 호흡 용량)를 복구하려는 쓸데없는 시도에서 전자 수송 및 산소 소비 속도를 최대 수준으로 증가시킴으로써 양성자 동기력의 소멸에 반응한다. 최대 호흡 용량과 기저 호흡의 차이는 세포의 예비 호흡 용량으로, 이는 세포가 기저 상태에서 ATP를 생성하는 데 사용되지 않는 호흡의 양을 나타내지만 ATP 수요의 증가 또는 스트레스8의조건 하에서 잠재적으로 모집 될 수 있다. 세 번째 주사는 로테네온과 항마이신 A의 조합이다. 이 주사는 ETC와 OCR이 가장 낮은 수준으로 감소하는 것을 완전히 막고, 나머지 산소 소비는 비 미토콘드리아 (NADPH-산화제 등에 의한)입니다.
대사 경로의 변화는 체외에서 사이토카인을 가진 NK 세포의 지속적인 활성화가 다른 대사 경로10,,11의연구에 의해 NK 세포 피로로 이어질 수 있음을 시사했기 때문에 어떻게 든 NK 세포의 기능을 예측할 수 있었다. NK 세포 대사 상태와 기능 사이의 상관 관계는 암 면역 요법의 관점에서 매우 중요하다. 본 분야에서, IL-15의 주입을 갖는 NK 세포의 활성화, 단독으로 또는 단일 클론 치료 항체와 병용하여 종양 세포 살해를 개선하기 위해 시험되었다12,,13,,14. 이러한 치료 전략에 대한 응답으로 NK 세포의 대사 상태에 대한 지식은 NK 세포 활성화 상태 및 살인 기능의 귀중한 예측을 제공 할 것입니다.
단핵구, T 및 B 세포와 같은 다른 골수성 및 림프구 세포에서 대사 경로에 대한 연구는15에 설명되고 최적화된 방법이16에발표되었다. 이 프로토콜에서 우리는 순수하고 실행 가능한 NK 세포의 높은 숫자를 산출하는 NK 절연 프로토콜과 세포 외 플럭스 분석기를 사용하여 대사 활동을 측정하는 최적화 된 프로토콜을 모두 결합하는 방법을 제공합니다. 여기서 우리는 이것이 휴식과 IL-15 활성화 된 인간 NK 세포에 있는 신진 대사 변경의 연구를 위한 유효한 방법임을 보여줍니다. 세포 외 플럭스 분석의 경우 세포 수 및 약물 농도와 같은 매개 변수가 테스트되고 최적화되었습니다. 다른 호흡 측정 방법에 비해 세포 외 플럭스 분석기는 완전히 자동화되어 매우 적은 양의 세포, 최대 92 개의 샘플을 동시에 테스트 할 수 있으므로 비교적 빠른 방식으로 높은 처리량 스크리닝 (여러 샘플 및 복제)을 허용합니다17.
이 방법은 NK 세포 대사를 공부하여 NK 세포 기능을 평가하는 데 관심이있는 연구원에 의해 사용될 수 있습니다. 그것은 그밖 사이토카인, 항체 또는 수용성 자극에 의해 활성화된 세포에 또한 적용될 수 있었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D8375-5G</td>
			<td>Glycolyisis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D198501</td>
			<td>ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>NK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDIVA Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT cell proliferation assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C7026</td>
			<td>Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>17851</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human NK cell Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>19055</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>10128-446</td>
			<td>NK sell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>NK cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td>Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15-50ug</td>
			<td>NK cell stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum (HS)</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>9C0539</td>
			<td>NK cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td>NK cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of stress test media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34965</td>
			<td>Viability dye for flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>50494X</td>
			<td>PBMCs separation from human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD3 BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563725</td>
			<td>T cell flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD56 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555516</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human NKp46 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557991</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>75351</td>
			<td>Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BP-115</td>
			<td>Cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Controller Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>Extracellular Flux assay base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Flux Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>To prepare the Cell-Tak solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of human natural killer cell metabolism

천연 킬러(NK) 세포는 주로 선천적 항종양 및 항바이러스 면역 반응을 중재하고 다양한 사이토카인 및 기타 자극에 반응하여 생존, 세포 증식, 인터페론 감마(IFNγ) 및/또는 세포 독성 프로그램과 같은 사이토카인의 생산을 촉진한다. 사이토카인 자극에 의한 NK 세포 활성화는 그들의 생에너지 및 생합성 요구 사항을 지원하기 위하여 신진 대사 통로의 실질적인 리모델링을 요구합니다. NK 세포 대사가 손상되면 NK 세포 대사를 결정하는 방법의 가용성의 임상 적 중요성을 강조하는 비만 및 암을 포함한 다수의 만성 질환과 관련이 있음을 시사하는 증거가 많이 있습니다. 여기서 우리는 인간 NK 세포의 에너지 대사의 변화를 모니터링하는 도구로, 글리코리시스와 미토콘드리아 산소 소비의 실시간 측정을 허용하는 플랫폼인 세포외 플럭스 분석기의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 방법은 또한 IL-15와 같은 사이토카인을 가진 NK 세포의 자극 후 대사 변화를 모니터링할 수 있게 해주며, 현재 광범위한 임상 시험에서 조사되고 있는 시스템이다.

말초 혈액에서 NK 세포의 격리는 순수하고 실행 가능한 인구를 제공합니다
세포 외 플럭스 분석은 우물에서 H+ 및 O2 농도의 측정을 기반으로하며 세포의 다른 집단 이나 생존가능성을 구별하지 않습니다. 이러한 이유로, 관심있는 세포의 매우 순수하고 실행 가능한 인구를 얻는 것은 이 실험에서 성공하기 위한 중요한 단계이었습니다.
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Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

본 논문에서, 우리는 말초 혈액에서 분리된 1 차적인 인간 자연 킬러 (NK) 세포에 있는 글리코리시스 및 미토콘드리아 호흡을 측정하는 방법을 기술합니다, 휴식 또는 IL15 유도된 활성화에 따라. 설명된 프로토콜은 다른 사이토카인 또는 수용성 자극에 의해 활성화된 1차 인간 NK 세포로 쉽게 확장될 수 있었다.

인간 자연 킬러 세포 대사의 분석

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

이 방법은 자연 킬러 세포 대사의 결정을 허용합니다. 세포외 배지의 산소 소비 및 pH 변화를 측정하여 활성화의 주요 매개 변수. 세포외 플럭스 분석기의 장점은 완전히 자동화되어 낮은 양의 세포로 실시간으로 최대 92개의 샘플을 테스트할 수 있다는 것입니다.따라서 높은 처리량 화면을 허용합니다. 엉뚱한 세포에서 글리코리시및 호흡을 결정하는 유효한 방법은 진료소에서 매우 중요합니다. 비만과 암 등 많은 질병이 있기 때문에, 세포 대사가 손상됩니다.림프구 분리 배지 의 20 밀리리터를 50 밀리리터 원내 튜브로 파이프로 전환하여 시작합니다. 튜브를 30도 각도로 유지하면서, 부드럽게 파이펫 20 밀리리터의 혈액을 매체에 걸쳐. 두 유체 간에 표시되고 잘 정의된 인터페이스를 만듭니다.1000회 G.G.에서 25분 동안 튜브를 원심분리한 다음 조심스럽게 원심분리기에서 튜브를 꺼내 랙에 넣습니다. LSM과 플라즈마 사이의 인터페이스에서 눈에 띄는 세포 층의 존재를 확인합니다. 10 밀리리터 플라스틱 파이펫으로 단일 핵 세포 층을 부드럽게 흡인하고 새로운 50 밀리리터 원판 튜브에 놓습니다.PBS의 45 밀리리터로 단핵 세포를 두 번 세척하십시오. 그리고 원심 분리는 5 분 동안 800 배 G에서 그들을 분리합니다. 천연 킬러 세포 또는 engaves를 격리하려면 PVM 바다를 계산하고 밀리리터 당 8 번째 세포로 10 번 NK 분리 버퍼로 재보힙하십시오.그런 다음 세포 현탁액의 10 밀리리터를 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮킨다. NK 세포 절연 항체 믹스의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 및 항체 CD 3개의 양성 절연 항체 믹스의 10 마이크로리터가 PBMC에 혼성한다.그리고 10 분 동안 실온에서 그들을 배양. 소용돌이 자기 구슬과 PBMC 및 항체에 1 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 MIGS를 실온에서 10분 동안 배양하고 가끔 교반합니다.NK 절연 버퍼 35밀리리터를 추가하고 튜브를 자석에 15분간 놓습니다. 튜브의 측면이나 바닥을 건드리지 않고 50 밀리리터 플라스틱 파이펫으로 상체를 조심스럽게 수집합니다. 세포를 계산하고 원심 분리기를 800 배 G에서 5 분 동안 계산합니다.용해 통로(15)로 NK 세포를 자극하기 위해, 96웰 플레이트의 우물에서 10%HS를 함유하는 IMDM의 100마이크로리터에서 750, 000세포를 재중단한다. IMDM에서 밀리리터당 15~ 1마이크로그램의 인간 통로와 10%의 HS를 희석시하십시오. 그리고 희석 된 인간 통로 (15)의 100 마이크로 리터를 세포에 추가합니다.자극되지 않은 세포로 제어 샘플을 복구하고 섭씨 37도에서 인큐베이터에 두 샘플을 배치합니다. 48 시간 동안 세포를 자극한 다음 세포 외 유행성 액수 분석작업을 수행합니다. 실험 전날 분석기를 켜고 섭씨 37도까지 따뜻하게 해보세요.검열 카트리지 패키지를 열고 카트리지를 유틸리티 플레이트에서 분리합니다. 그런 다음 교정 용액의 200 마이크로리터를 유틸리티 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 그리고 센서가 완전히 침수되었는지 확인하기 위해 중앙 카트리지를 다시 넣습니다.최적의 결과를 위해 이산화탄소 무료 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 카트리지를 섭씨 37도에서 배양합니다. 어느 제대로 가습. 접착제 코팅 블레이드를 준비하기 위해, 플레이트의 각 웰에 셀 접착제 용액의 파이펫 25 마이크로리터.실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 200 마이크로 리터의 멸균 물로 접시를 두 번 씻습니다. 우물이 건조할 수 있도록 세포 배양 후드 내부에 15분 동안 접시를 열어 두십시오.원심분리기 이전에 분리된 NK 셀은 5분 동안 200배 G를 추가합니다. 그런 다음 수퍼나티를 제거하고 온난한 미토콘드리아 스트레스 테스트 매체 또는 글리코리시스 응력 테스트 배지에서 세포를 세척합니다. 세포를 다시 펠렛하고 동일한 배지에서 선호하는 세포 농도로 다시 중단합니다.180 마이크로리터의 셀 서스펜션을 분석 판에 잘 넣습니다. 웰 A 1, A 12 H 1 및 H 12를 배경 보정을 위한 컨트롤 웰로 사용하십시오. 이 Wells Incubate에 분석 매체의 180 마이크로리터를 첨가하여 이산화탄소 없는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.5 분 동안 200 배 G에서 플레이트를 원심 분리합니다. 그런 다음 현미경의 밑에 세포를 관찰하여 우물 의 바닥에 마노 층을 형성하는지 확인합니다. 세포를 25분 동안 배양합니다.섭씨 37도에 따뜻한 작업 솔루션. 필요한 경우 pH를 7.4로 재조정합니다. 미토콘드리아 응력 테스트를 위해 이전에 준비된 화합물을 로드하거나 글리콜리시스 응력 테스트를 위해 수화 된 검열 카트리지의 보드 A, B 및 C에 로드된 검열 카트리지를 인큐베이터에 다시 넣습니다.세포외 플럭스 분석 프로토콜을 설정하려면 소프트웨어를 열고 그룹 정의를 사용하여 전처리 조건을 정의합니다. 플레이트 맵 탭을 사용하여 비슷한 조건이 있는 우물 그룹을 나타내기도 배경 보정 및 빈 우물을 나타냅니다. 그런 다음 프로토콜 탭에서 프로그램을 설정합니다.프로그램을 시작하고 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 트레이에 놓습니다. 교정 단계 후, 분석 플레이트의 교정판을 부착된 셀로 교체한다. 실행이 완료되면 데이터를 검색하고 분석합니다.NK 세포의 순도와 생존가능성을 평가하기 위해. PVM 바다와 고립된 NK 세포 집단의 작은 알렉 와트는 유동 세포측정에 의해 염색되고 분석되었다. NK 세포 집단의 순도는 CD 3 및 CD 56 또는 NKP 46에 대해 이중 체류하여 확립되었다.인간 NK 세포에 대한 미토콘드리아 산소 소비율이 많이 여기에 나와 있다. 예상대로 나는 셀 번호가 더 높은 OCR 값을 표시했다. 세포 수는 또한 우물에 있는 DNA 또는 단백질의 양과 선형적으로 상관.다른 한편으로는 더 높은 세포 수는 최적이 아니었다. DNP를 추가하면 우물의 산소 농도가 각 주기마다 완전히 고갈되었기 때문입니다. 이로 인해 OCR의 정확한 계산이 방지되었습니다.인간 NK 세포에서, 100 마이크로몰러 DNP는 최적의 용량으로 밝혀졌다. 750, 000 NK 세포를 잘 결합한 대표적인 미토콘드리아 스트레스 시험 실험이 여기에 나와 있다. 이 시험에서 올리고마이신은 산소 소비의 극적인 감소로 이어집니다.그리고 ECAR의 증가. 이는 글리코리시스로의 전환과 세포 ATP 수준을 유지하기 위한 노력을 나타냅니다. 통로(15)에 의한 NK 세포의 활성화는 미토콘드리아 산소 소비와 세포외 산성화 모두에서 증가를 일으켰다.기저 막시칼과 ATP 연결 호흡 증가 하지만 양성자 누출 또는 비 미토 콘 드리 아 호흡. 더욱이, OCR/ECA 속도는 IL 15 자극 후에 글리코리스틱 물질 대사로의 전환을 나타내는 감소. 이 프로토콜을 수행할 때, 최적의 세포 수를 결정하고 케이블의 농도를 적정화하기 위해 순수하고 건강한 세포 집단을 얻는 것이 매우 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

연구

면역학 및 감염병학

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...