Name: analysis of human natural killer cell metabolism
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism at JoVE.com

Författarna tackar Dr Michael N. Sack (National Heart, Lung, och Blood Institute) för stöd och diskussion. Denna studie stöddes av intramural Research Programs av National Institutes of Health, National Cancer Institute och National Heart, Lung, och Blood Institute. JT stöds av Ramon y Cajal-programmet (grant RYC2018-026050-I) av MICINN (Spanien).

Samtliga experiment utfördes i enlighet med deklarationen av Helsingfors etiska principer för medicinsk forskning. Perifera blodprov från givare erhölls från NIH Institutionen för transfusionsmedicin enligt 99-CC-0168 IRB godkänt protokoll, med patientens skriftliga informerat samtycke.
1. Reagenspreparat
<ol><li>
Reagenser för isolering av NK-celler ANMÄRKNINGAR: Förbered dessa reagenser i en cellkulturhuva.<ol>
<li>Förbered NK-separationsbuffert: Tillägg PBS...

<ol>
	<li>Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+natural+killer+cell+responses:+integration+of+signals+for+activation+and+inhibition.">Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition.</a> Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).</li><li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells.">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li><li>Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Proliferation+Induced+by+IL-15+Transpresentation+Is+Negatively+Regulated+by+Inhibitory+Receptors.">NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors.</a> Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).</li><li>Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-2+augments+natural+killer+cell+activity.">Interleukin-2 augments natural killer cell activity.</a> Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).</li><li>Anton, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-endocytosis+of+intact+IL-15Ralpha-IL-15+complex+from+presenting+cells+into+NK+cells+favors+signaling+for+proliferation.">Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).</li><li>Marcais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+checkpoint+kinase+mTOR+is+essential+for+IL-15+signaling+during+the+development+and+activation+of+NK+cells.">The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells.</a> Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).</li><li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements.">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases.">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).</li><li>Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Metabolism+and+Tumor+Microenvironment.">NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).</li><li>Felices, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+treatment+with+IL-15+exhausts+human+NK+cells+via+a+metabolic+defect.">Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+First-in-Human+Phase+I+Study+of+Subcutaneous+Outpatient+Recombinant+Human+IL15+(rhIL15)+in+Adults+with+Advanced+Solid+Tumors.">A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).</li><li>Conlon, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+by+Continuous+Intravenous+Infusion+to+Adult+Patients+with+Solid+Tumors+in+a+Phase+I+Trial+Induced+Dramatic+NK-Cell+Subset+Expansion.">IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).</li><li>Dubois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+Infusion+of+Cancer+Patients+Expands+the+Subpopulation+of+Cytotoxic+CD56(bright)+NK+Cells+and+Increases+NK-Cell+Cytokine+Release+Capabilities.">IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities.</a> Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).</li><li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects.">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes.">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions.">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).</li><li>Theorell, J., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Intracellular+Ca(2+)+Mobilization+in+Human+NK+Cell+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).</li><li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements.">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li><li>O'Brien, K. L., Finlay, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunometabolism+and+natural+killer+cell+responses.">Immunometabolism and natural killer cell responses.</a> Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).</li><li>Ahn, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+mitochondrial+deacetylase+Sirt3+in+regulating+energy+homeostasis.">A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).</li><li>Stram, A. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+mitochondria:+protein+signaling+in+the+powerhouse.">Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).</li><li>Armstrong, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+alters+mitochondrial+bioenergetics+and+modifies+pancreatic+cell+death+independently+of+cyclophilin+D,+resulting+in+an+apoptosis-to-necrosis+shift.">Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate.">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).</li><li>Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+lipophilic+cation+for+determination+of+membrane+potential+in+neuroblastoma-glioma+hybrid+cell+suspensions.">Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).</li><li>Michelet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+natural+killer+cells+in+obesity+limits+antitumor+responses.">Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).</li></ol>

I detta dokument har vi etablerat ett protokoll för att effektivt isolera och culturing ren och livskraftig primära mänskliga NK celler från perifert blod. Vi har också optimerat förutsättningarna för mätning av den metaboliska aktiviteten hos dessa NK-celler bedömda genom syreförbrukningshastighet och extracellulär försurningshastighet genom att använda en extracellulär fluxanalysator. Jämfört med andra respirometriska metoder, den extracellulära flux analysator är snabb, kräver ett litet antal celle...

Natural Killer (NK) celler är medfödda lymfocyter som medla anti-tumör och anti-viral svar. NK-celler omfattar 5-15% av alla lymfocyter i humant perifert blod, och kan också hittas i mjälte, lever, benmärg och lymfkörtlar. NK-celler uttrycker inte polymorfiska clonotypic-receptorer, såsom T-cellsreceptorer (TCR) eller B-cellsreceptorer (BCR). Däremot är aktiveringen av deras cytolytiska funktioner föranledd av engagemang av receptorer som känner igen invariable ligander på ytan av en målcell1,2.
Vila mänskliga NK celler isolerats från perifert blod kan överleva i flera dagar i kultur medium kompletteras med humant serum. Aktivering av NK-celler genom cytokiner som IL-15 eller IL-2 driver cellerna till spridning och till en ökning av deras avlivningsförmåga, bland andraeffekter 3,4,5. Flera studier har visat ett direkt samband mellan NK-cellaktivering och förändringar i deras metaboliska aktivitet6. Dessa metaboliska förändringar är avsedda att uppfylla de särskilda krav som finns i cellerna när det gäller energi och biosyntes.
Aeroba celler och organismer erhåller energi genom en serie kemiska reaktioner som involverar katabolism och oxidation av kolhydrater, fett och proteiner. Genom en kombination av glykolys, trikarboxylsyra (TCA) cykel och oxidativ fosforylering, eukaryota celler möta majoriteten av deras ATP efterfrågan och få intermediärer som krävs som byggstenar för makromolekyler väsentliga för celltillväxt och spridning. Processen för glykolys (Figur 1A) börjar med inträde av glukos i cellen. I cytosolen fosforyleras glukos och omvandlas till pyruvat (med en nettoproduktion av 2 molekyler atp per glukosmolekyl), som kan reduceras till laktat eller transporteras in i mitokondrierna för att omvandlas till Acetyl-CoA och gå in i TCA-cykeln. TCA cykeln fortsätter cykling drivs med fler molekyler av Acetyl-CoA och producerar CO2 (som så småningom kommer att diffusa utanför cellen och, genom att reagera med H2O i mediet, kommer att generera kolsyra som kommer att leda till försurning av mediet) och NADH, molekylen som ansvarar för att donera elektroner till elektrontransportkedjan (ETC). Elektronerna färdas genom olika proteinkomplex och accepteras slutligen av syre. Dessa komplex (I, III och IV) pumpar också H+ från den mitokondriematrisen in i intermembraneutrymmet. Som en följd av den elektrokemiska gradienten som genereras, kommer H+ in igen till matrisen genom den komplexa V (ATP-syntas), investera den potentiella energi som samlats in i generering av ATP.
Både glykolys och mitokondriell andning kan blockeras på olika punkter genom att använda inhibitorer. Kunskapen om och användningen av dessa hämmare låg till grund för utvecklingen av den extracellulära fluxanalysen. Genom att mäta två enkla parametrar i realtid som pH och syre, den extracellulära flux analysatorn härda till hastigheten av glykolys och mitokondriell andning i en 96-brunnsplatta. Glykolysstresstestet utförs i ett basalt medium utan glukos (Figur 1B)7. De första mätningarna av extracellulär försurningsgraden (ECAR) är indikativ för glykolysoberoende försurning. Det benämns icke-glykolytisk försurning och korrelerar med CO2 som produceras av TCA som, som förklarats tidigare, kombinerar med H2O i mediet för att generera H+ (TCA-linked ECAR). Den första injektionen är glukos för att inducera glukosutnyttjande och öka glykolys. Den andra injektionen kombinerar både rotenon, en Komplex I-hämmare, och antimycin A, en Complex III-hämmare tillsammans, för att blockera ETC. Cellerna svarar på denna dramatiska minskning av mitokondriell ATP-produktion genom att aktivera glykolys för att upprätthålla cellulära ATP-nivåer, och detta representerar mängden glykolys som inte används av cellen i basalt tillstånd men som potentiellt skulle kunna rekryteras som svar på ökningar i ATP-efterfrågan (kompenserande glys). Den tredje injektionen är glukosanalogin 2-Deoxyglukos (GD), som konkurrerar med glukos som substrat för enzymet hexokinas. Produkten av denna fosforylering, 2-deoxyglukos-6-fosfat kan inte omvandlas till pyruvat, och därför är glykolys blockerad, vilket sänker ECAR till sitt minimum. Ecar som mäts på denna punkt omfattar andra källor till extracellulär försurning som inte tillskrivs glykolys eller andningsaktivitet samt eventuell kvarvarande glykolys som inte helt hämmas av 2-DG (post 2-DG-acidification).
Mitokondriellt stresstestet utförs i ett medium med glukos (Bild 1C)8. De första mätningarna av syreförbrukningshastigheten (OCR) motsvarar baslinjen för mitokondriell respiration (basal respiration). Den första injektionen är oligomycin, som hämmar avkastningen av protoner genom ATP-syntas (komplexa V), blockerar ATP-syntes och därmed snabbt hyperpolarisera mitokondriellt membran, vilket förhindrar ytterligare protonpumpning genom andningskomplex, och leder till en minskning av OCR. Jämförelsen mellan respirationen vid baslinjen och det värde som ges genom tillsats av oigoycin representerar den ATP-kopplade respirationen. Den återstående oligomycin-okänsliga syreförbrukningens hastighet kallas protonläcka, som representerar flödet av protoner genom lipidbilayern eller proteiner i det inre mitokondriella membranet såsom transloosan adeninnukleotal9. Den andra injektionen är den uncoupler 2,4-dinitrofenol (DNP), en jonofor som inducerar en massiv inträde av H+ i mitokondriell matris, vilket leder till depolarisering av mitokondriellt membran och störningar av mitokondriellt ATP syntes. Celler svarar på proton-motivets avledning genom att öka elektrontransportens och syreförbrukningens hastighet till högsta nivåer i ett fruktlöst försök att återvinna membranpotentialen (maximal andningskapacitet). Skillnaden mellan den maximala luftvägarna kapacitet och den basala andningen är den extra respiratoriska kapaciteten av cellen, som föreställer beloppet av respiration som inte används av cellen för att frambringa ATP i det basala statligt men kunde vara potentiellt rekryterat som svar på förhöjningar i ATP-begäran eller under villkorar av spänning8. Den tredje injektionen är en kombination av rotenon och antimycin A. Denna injektion stoppar helt ETC och OCR minskar till sin lägsta nivå, med den återstående syreförbrukningen är icke-mitokondriell (orsakas av NADPH-oxidaser, etc.).
Förändringar i metaboliska vägar skulle på något sätt kunna förutsäga funktionen av NK-celler, eftersom det har föreslagits att kontinuerlig aktivering av NK-celler med cytokiner in vitro skulle kunna leda till NK-cellutmattning genom studier av olika metaboliskavägar 10,11. Korrelationen mellan NK-cellens metaboliska status och funktion är mycket viktig ur cancerimmunterapins synvinkel. I detta fält har aktivering av NK-celler med infusion av IL-15, ensam eller i kombination med monoklonala terapeutiska antikroppar testats i syfte att förbättra tumörcellsdödandet12,13,14. Kunskapen om NK-cellernas metaboliska status som svar på dessa behandlingsstrategier skulle ge en värdefull prediktor för NK-cellaktiveringsstatus och avlivningsfunktion.
Studien av metaboliska vägar i andra myeloisk och lymfoida celler såsom monocyter, T och B-celler har beskrivits15 och optimerade metoder har publicerats16. I detta protokoll tillhandahåller vi en metod som kombinerar både ett NK-isoleringsprotokoll som ger ett stort antal rena och livskraftiga NK-celler och ett optimerat protokoll för att mäta metabolisk aktivitet med hjälp av en extracellulär fluxanalysator. Här visar vi att detta är en giltig metod för studier av metaboliska förändringar i vila och IL-15 aktiverat mänskliga NK celler. För den extracellulära fluxanalysen har parametrar som celltal och läkemedelskoncentrationer testats och optimerats. Jämfört med andra respirometriska metoder, extracellulära flux analysator är helt automatiserad och kunna testa i realtid, med mycket låga mängder celler, upp till 92 prover samtidigt, och därmed tillåter hög genomströmning screenings (med flera prover och replikat) på ett relativt snabbt sätt17.
Denna metod kan användas av forskare som är intresserade av att bedöma NK-cellens funktion genom att studera NK-cellmetabolism. Det kan tillämpas också på celler som aktiveras av andra cytokiner, antikroppar eller lösliga stimuli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D8375-5G</td>
			<td>Glycolyisis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D198501</td>
			<td>ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>NK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDIVA Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT cell proliferation assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C7026</td>
			<td>Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>17851</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human NK cell Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>19055</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>NK cell isolation from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>10128-446</td>
			<td>NK sell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical tubes</td>
			<td>Falcon-Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>NK cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td>Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15-50ug</td>
			<td>NK cell stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum (HS)</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>9C0539</td>
			<td>NK cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td>NK cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of stress test media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34965</td>
			<td>Viability dye for flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>50494X</td>
			<td>PBMCs separation from human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD3 BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563725</td>
			<td>T cell flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD56 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555516</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human NKp46 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557991</td>
			<td>NK flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>75351</td>
			<td>Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>NK cell separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BP-115</td>
			<td>Cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Controller Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>Extracellular Flux assay base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Flux Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>To prepare the Cell-Tak solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Component of mitochondrial stress test medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of human natural killer cell metabolism

Natural Killer (NK) celler medla främst medfödda anti-tumör och anti-viral immunsvar och svara på en mängd olika cytokiner och andra stimuli för att främja överlevnad, cellulära spridning, produktion av cytokiner såsom interferon gamma (IFNγ) och /eller cytotoxicitet program. NK cell aktivering av cytokin stimulering kräver en betydande ombyggnad av metaboliska vägar för att stödja deras bioenergetiska och biosyntetiska krav. Det finns en stor mängd bevis som tyder på att nedsatt NK cell metabolism är associerad med ett antal kroniska sjukdomar inklusive fetma och cancer, som belyser den kliniska betydelsen av tillgången till en metod för att bestämma NK cell metabolism. Här beskriver vi användningen av en extracellulär fluxanalysator, en plattform som möjliggör realtidsmätningar av glykolys och mitokondriell syreförbrukning, som ett verktyg för att övervaka förändringar i energimetabolismen hos mänskliga NK-celler. Den metod som beskrivs här möjliggör också övervakning av metaboliska förändringar efter stimulering av NK-celler med cytokiner som IL-15, ett system som för närvarande undersöks i ett brett spektrum av kliniska prövningar.

Isolering av NK-celler från perifert blod ger en ren och livskraftig population
Den extracellulära fluxanalysen baseras på mätningen av H+ och O2-koncentrationen i brunnen och kommer inte att skilja mellan olika populationer av celler eller deras livsduglighet. Av denna anledning var det viktiga steget att lyckas med dessa experiment att få en mycket ren och livskraftig population av den cell som var av intresse.
Isolering...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism at JoVE.com

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

I detta dokument beskriver vi en metod för att mäta glykolys och mitokondriell respiration i primära mänskliga Natural Killer (NK) celler isolerats från perifert blod, i vila eller efter IL15-inducerad aktivering. Det protokoll som beskrivs skulle lätt kunna utvidgas till primära mänskliga NK celler aktiveras av andra cytokiner eller lösliga stimuli.

Analys av människans naturliga Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Denna metod möjliggör fastställandet av naturliga killer cell metabolism. En nyckelparameter i aktiveringen genom mätning av syreförbrukning och pH-förändringar i det extracellulära mediet. Fördelen med extracellulära flux analysatorn är att det är helt automatiserad och kunna testa upp till 92 prover i realtid med låga mängder celler.Därmed tillåter hög genomströmning skärmar. En giltig metod för att bestämma glykolys och andning i inky celler är mycket viktigt i kliniken. Eftersom det finns många sjukdomar inklusive fetma och cancer där inky cell metabolism är nedsatt.Börja med pipettering 20 milliliter av lymfocytseparation medium i en 50 milliliter koniska rör. Samtidigt som röret på 30 graders vinkel, försiktigt pipet 20 milliliter blod över mediet. Att skapa ett synligt och väldefinierat gränssnitt mellan de två vätskorna.Centrifugera rören i 25 minuter vid 1000 gånger G.Then försiktigt ta rören ur centrifugen och placera dem i ett rack. Kontrollera om det finns ett iögonfallande lager av celler vid gränssnittet mellan LSM och plasma. Aspirera försiktigt det mononukleära celllagret med en 10 milliliter plastpipett och placera den i ett nytt koniskt rör på 50 milliliter.Tvätta de mononukleära cellerna två gånger med 45 milliliter PBS. Och centrifugera dem vid 800 gånger G i fem minuter. För att isolera de naturliga mördarcellerna eller engaves, räkna PVM-haven och återanvänd dem i NK-separationsbufferten vid en tidpunkt 10 till åttonde cellerna per milliliter.Överför sedan 10 milliliter av cellupphängningen till ett nytt 50 milliliterrör. Tillsätt 500 mikroliter av NK-cellisoleringsantikroppsmix. Och 10 mikroliter av anti CD tre positiva isolering antikropp mix till PBMCs.Och ruva dem i rumstemperatur i 10 minuter. Vortex magnetiska pärlor och lägga till en milliliter till PBMCs och antikroppar. Därefter inkubera MIGS i 10 minuter vid rumstemperatur med tillfällig omrörning.Tillsätt 35 milliliter NK-isoleringsbuffert och placera röret på magneten i 15 minuter. Samla försiktigt upp supernatanten med en 50 milliliter plastpipett utan att röra vid sidorna eller rörets botten. Räkna cellerna och centrifugera dem vid 800 gånger G i fem minuter.För att stimulera NK-cellerna med löslig gång 15, resuspend 750, 000 celler i 100 mikroliter av IMDM som innehåller 10%HS i en brunn av en 96 brunnsplatta. Späd ut mänsklig gång 15 till ett mikrogram per milliliter i IMDM och 10%HS. Och tillsätt 100 mikroliter av den utspädda mänskliga gången 15 till cellerna.Reparera ett kontrollprov med ostimulerade celler och placera båda proverna i inkubatorn vid 37 grader Celsius. Stimulera cellerna i 48 timmar sedan utföra extracellulära flux analysen. Dagen före experimentet, slå på analysatorn och låt den värma upp till 37 grader Celsius.Öppna censurkassettpaketet och separera patronen från bruksplattan. Tillsätt sedan 200 mikroliter av calibrant-lösningen till varje brunn av bruksplattan. Och sätt tillbaka den centrala patronen för att se till att sensorerna är helt nedsänkta.För optimala resultat inkubera patronen över natten vid 37 grader Celsius i en koldioxidfri inkubator. Som ordentligt befuktade. För att förbereda ett självhäftande belagt blad, pipetter 25 mikroliter av celllimlösningen till varje brunn av plattan.Och inkuberas i rumstemperatur i 20 minuter. Ta sedan bort lösningen och tvätta plattan två gånger med 200 mikroliter sterilt vatten per brunn. Håll plattan öppen i 15 minuter inuti cellkulturhuven så att brunnarna torkar.Centrifugera de tidigare isolerade NK-cellerna tillför 200 gånger G i fem minuter. Ta sedan bort supernatanter och tvätta cellerna i värmt mitokondriellt stresstest medium eller glykolys stresstest medium. Pellet cellerna igen och återanvänd dem till den föredragna cellkoncentrationen i samma medium.Lägg 180 mikroliter av cellfjädring per väl in i analysplattan. Använd brunnar A en, A 12 H en och H 12 som kontroll brunnar för bakgrundskorrigering. Lägga till 180 mikroliter av analysmediet till dessa Brunnar Inkubera plattan i 30 minuter vid 37 grader Celsius i en koldioxidfri inkubator.Centrifugera plattan vid 200 gånger G i fem minuter. Observera sedan cellerna under mikroskopet för att kontrollera att de bildar ett manoskikt längst ner på brunnen. Inkubera cellerna i ytterligare 25 minuter.Varma arbetslösningar till 37 grader Celsius. Och justera deras pH till 7,4 om det behövs. Ladda de tidigare beredda föreningarna för ett mitokondriellt stresstest eller för ett glykolysstresstest i styrelserna A, B och C i den hydrerade censurpatronen Sätt tillbaka den laddade censurpatronen i inkubatorn medan du ställer in programmet.Om du vill ställa in protokollet för extracellulär fluxanalys öppnar du programvaran och använder Group definitioner för att definiera förbehandlingsförhållandena. Använd kartfliken Plate för att ange de grupper av brunnar som har liknande förhållanden Ange också bakgrundskorrigeringen och tomma brunnar. Ställ sedan in programmet i fliken protokoll.Starta programmet och placera sensorpatronen och nyttoplattan på facket. Efter kalibreringssteget, byt ut calibrantplattan för analysplattan med de bifogade cellerna. När körningen är slutförd, hämta data och analysera den.För att bedöma NK-cellernas renhet och livsduglighet. Små Alec Watts från PVM hav och den isolerade NK cellen befolkningen var färgas och analyseras av flöde cytometry. Renheten i NK cell befolkningen fastställdes genom att dubbla vistas mot CD tre och CD 56 eller NKP 46.Massor av mitokondriell syreförbrukning för de mänskliga NK-cellerna visas här. Som väntat jag cellnummer visas högre OCR-värden. Cellnummer korrelerade också linjärt med mängden DNA eller protein i brunnen.Å ena sidan numrerar högre cell var inte optimal. Eftersom vid tillsats av DNP, syrekoncentrationen i brunnen var helt utarmat i varje cykel. Vilket förhindrade den korrekta beräkningen av OCR.I mänskliga NK celler, 100 micromolar DNP befanns vara den optimala dosen. Ett typiskt mitokondriellt stresstestförsök med 750, 000 NK-celler per brunn visas här. I detta test Oligomycin leder till en dramatisk minskning av syreförbrukningen.Och en ökning av ECAR. Vilket representerar en övergång till glykolys och ett försök att upprätthålla cellulära ATP-nivåer. Aktivering av NK-cellerna genom gång 15 orsakade en ökning av både mitokondriell syreförbrukning och extracellulär försurning.Basal Maximal och ATP länkade andning ökade men inte proton läcka eller icke mitokondriell respiration. Vidare minskade OCR/ECA-kursen Indikerar en övergång till en glykolytisk metabolism efter IL 15 stimulering. När du utför detta protokoll är det mycket viktigt att få en ren och frisk cellpopulation för att bestämma det optimala celltalet och att titrera koncentrationen av uncablers.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Beredning och användning av HIV-1 infekterade Primär CD4 + T-celler som målceller i Natural Cytotoxiska Killer Cell analyser

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En parasit Rescue och Transformation analys för Antileishmanial screening mot intracellulära<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Human akut monocytisk leukemicellinjen

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Konstgjord antigenpresenterande cell (AAPC) medierad aktivering och utbyggnad av naturliga mördarceller T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-upplösning avbildning av Natural Killer Cell Immunologisk Synapse på en Glass-stött Planar lipidbiskiktet

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocytisolering från human hud för fenotypisk analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimerad metod för att isolera och utöka Invariant Natural Killer T-celler från musmjälte

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Kvantifiera mänskliga monocyt Chemotaxis In Vitro och murina lymfocyter Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm bildning i Candida albicans med en automatiserad mikroflödessystem enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...