Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

نود أن نعترف بالعديد من المرضى في مركز كولورادو للطب التناسلي (CCRM) الذين تبرعوا بكرم أجنةهم للأبحاث. نود أيضا أن نشكر كارين Maruniak والمختبر السريري في CCRM لمساعدتهم في معالجة عينات hCG، وكذلك سو ماكورميك وفريقها السريري IVF علم الأجنة في CCRM لمساعدتهم في جمع الأجنة، وتخزين، وتتبع، وتبرع. وقد قدم التمويل داخلياً من جانب اللجنة المعنية باتفاقية مكافحة التصحر.

وقد تم التبرع بجميع الأجنة البشرية بموافقة لاستخدامها في البحوث. وقد وافق المجلس الغربي لمراجعة المؤسسات (دراسة رقم 1179872) على بروتوكولات لثقافة الأجنة البشرية الموسعة، وتتبع المبادئ التوجيهية الدولية. يجب مراجعة أي استخدام للأجنة البشرية من قبل الأخلاقيات المناسبة ومجالس الإدارة المرتب...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

وقد سمح تطوير بروتوكول لزراعة الأجنة البشرية من خلال زرع العلماء لاستكشاف وقت مجهول سابقا في التنمية8,9. هنا، نستخدم نظام ثقافة ممتد لثقافة الأجنة البشرية وندرس التمايز الأرومية المبكر قبل تشكيل المشيمة الزهية. تسمح لنا الطرق الموصوفة هنا بجمع خطوط فرعية م?...

من الصعب تاريخياً التحقيق في زرع الإنسان وظهور المشيمة المبكرة ولا يزالان مجهولين إلى حد كبير لأن الأنسجة البشرية لا يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التي لا يمكن فيها اكتشاف الحمل سريرياً. النماذج الحيوانية غير كافية، حيث أن المشيمة البشرية لها ميزاتها الفريدة مقارنة بالثدييات الأوروبية الأخرى. على سبيل المثال ، تغزو المشيمة البشرية بعمق في decidua مع بعض الخلايا الأرومية التي تصل على الأقل إلى الثلث الداخلي من ميوميتوميوم الرحم بينما تعيد الخلايا الأخرى تشكيل الشرايين الحلزونية الرحمية. حتى أسلافنا التطورية الأقرب، الرئيسيات غير البشرية، تظهر الاختلافات في مورفولوجيا المشيمة والتفاعلات الأرومية مع الأنسجة الوَرَقِية الأمومية1،2،3. الحصول على ما قبل زرع الأجنة البشرية في المختبر لم يكن ممكنا حتى في عام 1980 عندما بدأ الإخصاب البشري السريري في المختبر (IVF) كممارسة روتينية لعلاج العقم4. الآن، يمكن زراعة الكيسات البشرية في المختبر للسماح باختيار أجنة أكثر قابلية للحياة لنقلها، فضلا عن تمكين الاختبارات الجينية الآمنة. وقد أدى التحسن في تقنيات زراعة الأجنة، فضلا عن زيادة استخدام التلقيح الاصطناعي العديد من البلاستوسيستات الفائضة التي لا تزال بعد الانتهاء من دورات علاج المريض. مع موافقة المريض، موافقة IRB، ومع بعض القيود، يمكن استخدام هذه البلاستوسيست للدراسات البحثية. لقد أصبحت موردا لا يقدر بثمن التي كانت تستخدم لاشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية5, فهم انتقال كتلة الخلايا الداخلية إلى الخلايا الجذعية الجنينية6,7, ومؤخرا, وقد تم استزراع بنجاح حتى يوم (D) 13 لإعادة تشكيل زرع الإنسان8,9. من خلال الاستفادة من النهج التي وضعت مؤخرا أوميكس خلية واحدة، والوصول إلى هذه الزرع في مرحلة أنسجة الأجنة البشرية قد عرضت فرصا فريدة لوصف الآليات الجزيئية التي تنظم هذه العملية تمايز الخلايا ديناميكية للغاية، والتي كان من المستحيل في السابق لاستكشاف10،11،12،13.
هنا، نحن وصف الأساليب المستخدمة في نشرتنا الأخيرة التي تميز ديناميات التمايز trophoblast أثناء زرع الإنسان12. ويشمل هذا البروتوكول ارتفاع درجة حرارة الخلايا البلاستية vitrified، وتربية الجنين الموسعة تصل إلى D12 بعد التلقيح الاصطناعي، والهضم الأنزيمي للجنين في خلايا واحدة، وجمع الخلايا للمصب المقايسات(الشكل 1). هذا النظام ثقافة موسعة تدعم مرحلة ما قبل زرع تطور الجنين البشري دون مدخلات الأم وتلخص التمايز trophoblast التي تظهر متسقة مع الملاحظات التي أجريت من العينات النسيجية منذ سنوات عديدة14,15,16,17. أثناء الزرع، يتكون عدد الخلايا الدودة التورفوبلاستية من نوعين على الأقل من الخلايا: الخلايا ذات الأصل الأحادي النوى الشبيهة بالسيلوتروبوفبلاست (CTB) والـ متزامنة متعددة النوى (STB) متمايزة بشكل ميؤوس من شفائها. عند هضم التربسين ، فإن CTB هي خلايا صغيرة مستديرة لا يمكن تمييزها بشكل مورفولوجي عن أنساب الخلايا الأخرى (الشكل 2A، اللوحة اليسرى). فصل CTB من أنساب الخلايا الأخرى، مثل الغموض و endoderm البدائية، يمكن تحقيقه من خلال ملفاتهم الشخصية المستنسخة المتميزة التي كشفت عنها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يمكن التعرف بسهولة على خلايا Syncytiotrophoblast على أنها هياكل غير منتظمة الشكل أكبر بكثير من أنواع الخلايا الأخرى وتقع بشكل رئيسي في محيط الجنين(الشكل 2A، اللوحة الوسطى ؛ الشكل 2B، لوحة اليسار). الخلايا التروبيبلاستية المهاجرة (MTB) هي آخر الترومبوست sublineage وجدت خلال نموت الجنين وتمدد ويمكن التعرف على أنها تتحرك على ما يبدو بعيدا عن الجسم الرئيسي للجنين(الشكل 2A، لوحة الحق ، الشكل 2B، لوحة الحق). الترود الأروميست المهاجر ، على الرغم من التعبير عن العديد من العلامات نفسها مثل trophoblast (EVT) ، لا ينبغي أن يشار إليه باسم EVT ، لأن الهياكل التافهة في المشيمة لم تظهر في هذه المرحلة المبكرة من التطور.
تجريبيا، كنا قادرين على جمع CTB صغيرة وكبيرة STB التي يمكن تمييزها بسهولة بعد يتم هضم الأجنة في خلايا واحدة في D8، D10، وD12(الشكل 2A، B). تنشأ التروبيبلاستات المهاجرة في المراحل اللاحقة من زراعة الجنين الممتدة ويمكن جمعها عند D12 قبل الهضم الأنزيمي للجنين بأكمله(الشكل 2A, B). عن طريق فصل ظاهري هذه الثلاثة الفواصل الفرعية trophoblast قبل تحليل خلية واحدة، يمكننا تحديد علامات النسخ محددة وتحديد الدور البيولوجي لكل نوع خلية. Cytotrophoblast هي الانتشارية للغاية وتعمل كخلايا السلف في توريد STB وMTB ينساب متباينة10,11,12,13. Syncytiotrophoblast تشارك في انتاج هرمونات المشيمة للحفاظ على الحمل ، ويمكن أيضا أن تكون مسؤولة عن الأجنة التجشؤ في بطانة الرحم10،11،12،13. التربوبلاست المهاجرة لديها ميزات أقوى من النمط الظاهري الغازية، و المهاجرة ومن المرجح أن تكون مسؤولة عن أعمق وأكثر اتساعا استعمار بطانة الرحم10,11,12,13. بعد تعريف التوقيع النسخي لكل نوع خلية، كشفت تحليلات التجميع أيضاً عن مجموعتين فرعيتين إضافيتين من الخلايا التي لا يمكن تمييزها بشكل مورفولوجي عن CTB وكان لها نسخ مع ميزات STB وMTB، على التوالي12. ومن المرجح أن تكون هذه الخلايا المتوسطة في مرحلة التمييز من CTB إلى المستويات الفرعية MTB أو STB، وكان سيتم تجاهلها إذا تم هضم الأجنة بشكل أعمى وفصل الخلايا عن طريق النسخ وحدها.
يستخدم البروتوكول الموصوف هنا نظام ثقافة ثنائي الأبعاد (2D) وقد لا يكون الأمثل لدعم التنمية الهيكلية ثلاثية الأبعاد ( 3D ) ، كما اقترح منشور حديث يصف نظام ثقافة ثلاثية الأبعاد تم تطويره حديثًا13. ومع ذلك، في هذا النظام 2D التمايز من trophoblast في وقت مبكر يبدو أن تتفق مع الملاحظات التي أجريت من العينات في vivo14،15،16،17. ويمكن أيضا أن يكون هذا البروتوكول بسهولة تكييفها للاستخدام في نظام الثقافة 3D وصفها مؤخرا13 مع الحد الأدنى من التغييرات. يتم تنفيذ جميع الخطوات مع ماصة micromanipulation المحمولة مع نصائح المتاح تجاريا المتاح أو ماصة الفم من ماصة الزجاج سحبت ناعما تعلق على أنابيب المطاط، وتصفية، وبوق.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

زرع الإنسان، والرضا والالتصاق على سطح الرحم epithelia والغزو اللاحق للبلاستيس في decidua الأم، هو حدث البيولوجية الحرجة ولكن ملغز التي كانت تاريخيا صعوبة في الدراسة بسبب القيود التقنية والأخلاقية. يتم البدء في عملية الزرع عن طريق تطوير التروبكتوميرم إلى الأرومية المبكرة والتمايز اللاحق إلى خطوط فرعية متمايزة. قد يؤدي التمايز التروبيبلاستي المبكر المُنحرف إلى فشل الزرع وأمراض المشيمة وتشوهات الجنين والإجهاض. وقد تم مؤخراً تطوير طرق تسمح للأجنة البشرية بالنمو حتى اليوم الثالث عشر بعد الإخصاب في المختبر في غياب أنسجة الأمومة، وهي فترة زمنية تشمل فترة الزرع في البشر. وقد أعطى هذا الباحثين الفرصة للتحقيق في زرع الإنسان واختصار ديناميات التمايز trophoblast خلال هذه الفترة الحرجة دون الخلط بين التأثيرات الأم وتجنب العقبات الكامنة في دراسة الأحداث المبكرة لتمايز الأجنة في الجسم الحي. لتوصيف مختلف الطانيف الفرعية trophoblast أثناء الزرع، اعتمدنا القائمة ثنائية الأبعاد (2D) أساليب الثقافة الموسعة ووضعنا إجراء لهضم وعزل الأنزيمية أنواع مختلفة من الخلايا trophoblast لمقايسات المصب. الأجنة المستزرعة في ظروف ثنائية الأبعاد لديها مورفولوجيا مسطّحة نسبيًا وقد تكون دون المستوى الأمثل في النمذجة في العمارات الجنينية ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. ومع ذلك، يبدو أن التمايز الأرومية أقل تأثرا كما يتضح من التغيرات المتوقعة في المورفولوجيا والتعبير الجيني على مدى الثقافة الممتدة. يمكن فصل مختلف التوروفوبلاست sublineageages، بما في ذلك cytotrophoblast، syncytiotrophoblast وتوروفوبلاست المهاجرة حسب الحجم، والموقع، والظهور الزمني، واستخدامها لمزيد من التوصيف أو التجريب. قد يكون فحص هذه الخلايا الأرومية المبكرة مفيدًا في فهم زرع الإنسان ، وعلاج أمراض المشيمة الشائعة ، وتخفيف حدوث فقدان الحمل.

أظهرت الأجنة السليمة استمرار انتشارها على مدى انتشارها(الشكل 2B). بدأت الأجنة غير الطبيعية في التراجع عن حوافها الخارجية وتتفكك (الشكل 2C). من تجربتنا، تم إرفاق ما يقرب من 75٪ من الأجنة إلى الجزء السفلي من طبق ليفي المغلفة في 48 ساعة، وزاد المرفق إلى ما يقرب من 90?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

هنا ، نحن وصف طريقة للاحترار البلاستوسيستات البشرية vitrified ، وزراعة لهم من خلال فترة زرع في المختبر ، وهضمها في خلايا واحدة وجمع الخلايا الأرومية في وقت مبكر لمزيد من التحقيق.

مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

يفشل العديد من حالات الحمل في وقت مبكر من تطور الأجنة البشرية حول سبعة أو ثمانية بعد الإخصاب. هذا البروتوكول يوفر فرصا للمحققين لزراعة المفاهيم البشرية في المختبر خلال هذه النافذة زرع غامضة. وهذا يسمح لنا بفهم الآليات التي تدعم نجاح زرع الإنسان وتشكيل المشيمة المبكر.إن استخدام نظام ثقافة ممتد لزراعة الأجنة البشرية في مرحلة الزرع في المختبر هو على الأرجح الطريقة الوحيدة للحصول على مواد أصلية لدراسة الزرع والتمايز التروديبلاستي المبكر. هذه التقنية المباشرة هي أداة قوية تسمح لنا بالإجابة على العديد من الأسئلة الأساسية حول التنمية البشرية المبكرة. وسوف تسهم الأبحاث التي أجريت باستخدام هذا البروتوكول إلى حد كبير في فهم فقدان الحمل المبكر، وفشل زرع المتكررة وأمراض المشيمة.ومن خلال هذا الإجراء، ستكون ديردري لوجسدون، طالبة الدكتوراه من أحد المختبرات. قبل يوم واحد من احترار الجنين، قم بإعداد لوحات الوسائط والاسترداد في غطاء تدفق معقم. ملء اثنين من مركز جيدا الجهاز ثقافة غسل الأطباق مع 500 ميكرولترات من BM مع 10٪ SPS، ثم تغطية BM مع 500 ميكرولترات من زيت الصف ثقافة الجنين.في طبق زراعة الأنسجة 16 ملليمتر، طبقة ثمانية ملليلتر من زيت ثقافة الجنين ومرساة 20 قطرات ميكرولتر من BM مع 10٪ SPS إلى القاع. اكويل أطباق الغسيل وطبقة الانتعاش في حاضنة في 37 درجة مئوية، 6٪ ثاني أكسيد الكربون و 5٪ الأكسجين لمدة أربع ساعات على الأقل. Aliquot ما يقرب من أربعة ملليلتر من IVC 1 في أنبوب سقف المفاجئة خمسة ملليلتر وإعداد طبق واحد غسل مع 500 ميكرولترات من IVC 1 مع عدم وجود تراكب الزيت.اكويل الطبق و الأنبوب في الحاضنة لمدة أربع ساعات على الأقل. تخفيف الليفية من مصل الإنسان في برنامج تلفزيوني إلى 30 ميكروغرام لكل ملليلتر. فتح حزمة الأغطية الثمانية ذات الغرف المحجرة بعناية عدم لمس الآبار ، ثم الماصات 250 ميكرولترات من الليفي في كل بئر.استبدل الغطاء على غطاء الغطاء وحضنه بأربع درجات مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة. إعداد لوحة الثقافة الموسعة في صباح يوم احترار الجنين. استرداد زلة الغطاء مع الليفية وضعه في غطاء تدفق laminar.ثم إزالة خليط fibronectin مع ماصة ملليلتر واحد وتجاهله. Pipette 300 ميكرولترات من IVC 1 التوازنية في كل بئر ووضع الغطاء في الحاضنة حتى إزالة pellucida زونا. بعد ارتفاع درجة حرارة واستعادة الأجنة البشرية D5، وتقييمها لإعادة التوسع واتخاذ صور لكل جنين.نقل كل جنين إلى 500 ميكرولترات من اغضاءة معالجة موبوءة المتوسطة مع 5٪ FCS. ثم تعامل مع حل تيرود الحمضية كما هو موضح في مخطوطة النص. نقل على الفور الجنين مع زونا حل في 300 ميكرولترات من MOPS الدافئة المخزنة المتوسطة لإخماد حل التيرود.ثم نقل الجنين إلى طبق أنسجة الجهاز بشكل جيد مركزي يحتوي على BM المُعَسَن مع 10٪ SPS تحت زيت الصف لثقافة الجنين. ثم ارجع الجنين إلى 20 ميكرولتر انخفاض الانتعاش. قم بنقل الأجنة بشكل فردي إلى طبق الغسيل مع وسائط IVC 1 المُعَسَّنة، ثم قم بتحريك كل جنين بعناية إلى بئر من الغطاء المُغَرَف، مع التأكد من تتبع عملية تحديد الجنين.إعادة غطاء الغرف إلى حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية، 6٪ ثاني أكسيد الكربون والأكسجين في الغلاف الجوي لمدة يومين. في اليوم الثاني من النمو، تفحص بعناية تعلق الأجنة تحت المجهر وتبادل وسائل الإعلام. تعرف على الجنين الذي تعلق على الطبق عن طريق التنصت بلطف على لوحة.لتغيير الوسائط، قم بإزالة الغطاء واتم بعناية 150 ميكرولترات من IVC 1، مع الحرص على عدم إزعاج الجنين المرفق. إذا لم يكن الجنين قد تعلق بعد على لوحة، لا تبادل وسائل الإعلام لأن المصل في IVC 1 سوف تساعد في المرفق. ببطء ماص 150 ميكروليترس من وسائل الإعلام الثقافة الموسعة التوازن، IVC 2 في كل بئر واستبدال الغطاء على غطاء.عاد بعناية coverslip غرفة إلى الحاضنة. كرر تبادل وسائل الإعلام والتحقق من المرفقات كل يوم حتى الأجنة جاهزة لل التثبيت أو الهضم خلية واحدة. إذا كان جمع وسائل الإعلام المستهلكة ضروريًا لمزيد من التحليل ، قم بتجميد 150 ميكرولترات من IVC 1 التي تمت إزالتها إلى أنبوب منخفض الربط معقمة 0.5 ملليلتر.اغسل كل جنين مرة واحدة مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، ثم أضف 200 ميكرولترات من محلول التربسين لكل بئر. إرجاع غطاء الأغطية المُغطّاة إلى الحاضنة لمدة خمس دقائق. استخدام ماصة صغيرة أو ماصة الفم سحبها ناعما لالتقاط MTB الفردية ثم استخدام ماصة أكبر لتفكك بلطف الجنين عن طريق الطامح صعودا وهبوطا.استمر في اغراء الجنين بلطف وبشكل متكرر باستخدام طرف ماصة قطره أصغر حتى يتم احتضان الجنين لما مجموعه 10 دقائق في التربسين. لتنفيذ اختيار خلية واحدة، نقل الخلايا المنفصلة من خلال 320 قطرات غسل ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 0.1٪ PVP تحت زيت ثقافة الجنين، مع الحرص على عدم فقدان أي خلايا. بعد غسل الخلايا استخدام ماصة الزجاج سحبت ناعما لتحديد خلية واحدة.ماصة بعناية الخلية المفردة في أنبوب معقمة 0.2 ملليلتر منخفضة الربط مع الحد الأدنى من حجم برنامج تلفزيوني وPVP. التقط الخلايا الفردية الحرة في النيتروجين السائل وتخزينها في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام. أظهرت الأجنة السليمة استمرار انتشارها على مدى انتشارها الممتد، في حين بدأت الأجنة غير الطبيعية في التراجع عن حوافها الخارجية وتفككت.في اليوم ثمانية بعد الإخصاب، كانت معظم الخلايا في الأجنة cytotrophoblast أو CTBs، التي كانت إيجابية لعلامة trophoblast جاتا-3. على أطراف الجنين ، كانت CTBs تفرق بالفعل إلى مزامنة متعددة النواة ، والتي كان لها ورقة مثل المظهر وملطخة إيجابية للبشر CGB. في اليوم 10، كان تشكيل الخلايا التروفوبلاستية المهاجرة المهاجرة CGB في الحد الأقصى، وهو ما أكده ارتفاع إنتاج قوات حرس السواحل الهايتية في هذا الوقت.الترومبلات المهاجرة التي تلطخت إيجابية لHLA-G، كما بدأت في الظهور والهجرة بعيدا عن جسم الجنين. وبحلول اليوم الثاني عشر، كان التمايز في الـ STB في تراجع وأصبح إنتاج MTB أكثر بروزًا، مما يشير إلى تحول التركيز من إنتاج الهرمونات في اليوم 10 إلى هجرة الخلايا في اليوم 12. ويمكن ملاحظة هذه التغييرات في الفيديو الفاصل الزمني من فترة زرع شبه.الفيديو يدل على انهيار blastocele ، وتشكيل STB ، والتمايز في نهاية المطاف والهجرة من MTB. أهم شيء يجب أن نأخذ في الاعتبار عند الانتهاء من هذا الإجراء هو أنك تعمل مع الأجنة الحية التي هي حساسة للتغيرات في درجة الحرارة، وosmolality ودرجة الحرارة. التقليل من مقدار الوقت الذي تكون عليه الأطباق خارج الحاضنة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على صحة الجنين.بعد الانتهاء من هذا الإجراء، يمكن للمحققين استخدام خلايا واحدة معزولة لمصب الخلية الواحدة أوميكات المقايسات، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة وتسلسل بيسولفيت الجينوم كله لفهم أفضل التغيرات اللاجينية والنسخية خلال زرع الإنسان وتشكيل المشيمة في وقت مبكر.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

وضع عامل النمو المغلفه الخرز على أجنة الدجاج المرحلة المبكرة

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Electroporations OVO في مرحلة الجنين سمو الدجاج 10

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

اشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

وحيد الخلية في الأجنة ترنسفكأيشن الفرخ

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

عزل خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية ماوس والأرومة الغاذية الفحص الغزو

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...