Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
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我们要感谢科罗拉多生殖医学中心（CCRM）的许多患者慷慨地捐赠了他们的胚胎用于研究。我们还要感谢卡伦·马鲁尼亚克和CCRM的临床实验室在处理hCG样品方面的帮助，以及苏·麦考密克和她的临床IVF胚胎学团队在CCRM的胚胎收集、储存、跟踪和捐赠方面的帮助。资金由CCRM内部提供。

所有人类胚胎都经同意捐赠用于研究。扩大人类胚胎培养议定书已获西方机构审查委员会批准（研究第1179872号），并遵循国际准则。使用人类胚胎的任何用途必须由与使用本协议的研究机构相关的相关道德和理事机构进行审查。
1. 准备
<ol><li>在胚胎加热前一天，在无菌层流罩中准备介质和恢复板。<ol>
<li>用 10% v/v 血清蛋白替代品 （SPS） 准备 2 mL 的风细胞培养基 （BM）。<br...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. 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通过植入培养人类胚胎的协议的制定，使科学家能够探索一个以前未知的发育时间。,9在这里，我们使用一个扩展的培养系统来培养人类胚胎，并在小胎盘形成之前研究早期成肌细胞分化。此处介绍的方法允许我们收集不同的 TB 子线，用于下游单细胞分析。这项工作使科学界有机会了解人类发展的这一关键和神秘的时期，并可能为流产或其他性腺病理?...

人类植入和早期胎盘的出现在历史上很难调查，而且在很大程度上仍然未知，因为当怀孕在临床上无法察觉时，人体组织在这个阶段是无法接近的。动物模型不足，因为与其他动物哺乳动物相比，人类的放置有其独特的特征。例如，人类胎盘侵入到十分深，一些细胞细胞至少达到子宫肌膜的内三分之一，而其他细胞则重塑子宫螺旋动脉。即使是我们最亲密的进化祖先，非人类灵长类动物，也表现出与母体十,化组织1、2、3的胎儿形态和成骨细胞相互作用的差异。直到20世纪80年代，临床人类体外受精（IVF）开始作为治疗不孕症的常规做法，才有可能在体外获得人类胚胎。现在，人类胚胎可以在体外生长，以便选择更可行的胚胎进行移植，并实现安全的基因测试。胚胎培养技术的改进，以及试管婴儿的使用日益增多，产生了许多多余的胚胎，这些胚胎在患者的治疗周期完成后仍然存在。经患者同意、IRB 批准以及某些限制，这些囊肿可用于研究。它们已成为用于获得人类胚胎干细胞5的宝贵资源，了解内细胞质量向胚胎干细胞6、7,的过渡，最近，它们被成功培养，直到第（D）天（D）13，重塑人类植入8、9。,9通过利用最近开发的单细胞组理方法，获得这些植入阶段人类胚胎组织提供了独特的机会来描述调节这种高度动态细胞分化过程的分子机制，这些机制以前是不可能探索的10、11、12、13。,11,12,13
在这里，我们描述了我们最近的出版物中使用的方法，这些方法描述了人类植入12期间成体细胞分化的动态。该协议包括维他化胚胎的升温，将胚胎培养扩展到D12后IVF，将胚胎酶消化成单细胞，以及细胞收集用于下游测定（图1）。这种扩展的培养系统支持近植入阶段人类胚胎发育，无需母体输入，并重述了与,多年前14、15、16、17等组织,15学标本的观察16结果一致的成骨细胞分化。在植入过程中，成粒细胞群体由至少两种细胞类型组成：单核祖细胞细胞（CTB）和端膜分化的多核同步细胞（STB）。在三辛消化时，CTB是小而圆的细胞，在形态上与其他细胞系系无法区分（图2A，左面板）。CTB与其他细胞系系（如表膜细胞和原始内端膜）的分离可以通过单细胞RNA测序揭示的不同转录特征实现。同步细胞很容易被识别为不规则形状的结构，明显大于其他细胞类型，主要位于胚胎的外围（图2A，中间面板;图 2B，左面板）。移殖成细胞（MTB）是在胚胎扩展培养过程中发现的另一种成吉本细胞亚系，可以识别为似乎远离胚胎主体（图2A，右面板，图2B，右面板）。移栖成虫虽然表达许多与额外小虫细胞相同的标记，但不应称为EVT，因为胎盘中的双生结构尚未在发育的早期阶段出现。
在实验中，我们能够收集到小CTB和大型STB，这些在胚胎被消化成D8、D10和D12的单细胞后很容易区分（图2A，B）。迁移性成虫在胚胎发育的后期产生，可以在D12收集，然后对整个胚胎进行酶消化（图2A，B）。通过表型分离这三个三个三个三个三个三族细胞子系在单细胞分析之前，我们可以识别特定的转录标记，并定义每种细胞类型的生物学作用。细胞萎缩细胞是高度增殖的，在提供STB和MTB分化血统10，11，12，13,11,12时充当祖细胞。同步性细胞参与生产胎盘激素来维持妊娠，并可能负责胚胎钻进内膜10，11，12，13。10,11,12,13迁徙的龙骨细胞具有更强烈的侵入性，迁移表型的特点，并可能导致子宫子宫,内膜10，11，12，13,11,12的更深入和更广泛的殖民化。在定义每种细胞类型的转录特征后，聚类分析还发现另外两个细胞子集，这些细胞在形态上与CTB无法区分，并且具有STB和MTB特征的转录组，分别是12。这些中间阶段细胞很可能在从CTB到MTB或STB子系的区分过程中，如果胚胎被盲目消化，细胞被转录组单独分离，就会被忽视。
此处描述的协议使用二维 （2D） 培养系统，可能不理想支持三维 （3D） 结构开发，正如最近一份描述新开发的 3D 文化系统13 的出版物所建议的那样。然而，在这个2D系统中，早期成体细胞的分化似乎与体内标本14、15、16、17,15,16的观察结果一致。此协议也可以很容易地适应到最近描述的 3D 培养系统13 中的使用，变化最小。所有步骤都使用手持式微操作移液器进行，该移液器配有市售的一次性吸管或从连接到橡胶管、过滤器和喉舌的细拉玻璃移液器中移液器中移液器。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

人类植入，对子宫表面上皮的定位和附着力，以及随后对母体十分细胞的侵扰，是一个关键但神秘的生物事件，由于技术和伦理上的限制，在历史上一直难以研究。植入是由早期三磷细胞的营养细胞发育和随后分化为不同的成吉龙体亚系而启动的。畸变早期成体分化可能导致植入失败、胎盘病理、胎儿异常和流产。最近，人们已经开发出一些方法，允许人类胚胎在没有母体组织的情况下生长到体外受精后的第13天，这一时期包括人类植入期。这给了研究人员机会，研究人类植入和重述在这个关键时期，不混淆母体影响和避免内在的障碍，研究早期胚胎分化事件在体内的动态。为了描述植入过程中不同的成虫细胞亚系，我们采用了现有的二维（2D）扩展培养方法，并开发了一种酶消化和分离不同类型的成吉本细胞进行下游测定的程序。在二维条件下培养的胚胎具有相对扁平的形态，在体内三维（3D）胚胎结构建模方面可能不理想。然而，在扩展培养过程中，预期形态和基因表达变化表明，成图细胞分化的影响较小。不同的成虫细胞亚系，包括细胞萎缩细胞、同步性细胞和迁徙成虫细胞，可以按大小、位置和时间出现来分离，并用于进一步表征或实验。研究这些早期成体细胞可能有助于理解人类植入，治疗常见的胎盘病理，并减轻妊娠损失的发生率。

健康胚胎在扩展培养过程中持续增殖（图2B）。异常胚胎开始从外缘缩回并解体（图2C）。根据我们的经验，大约75%的胚胎在48小时时附着在纤维素涂层盘的底部，在培养中，附着在72小时时增加到约90%。胚胎附件的成功可能在很大程度上受到胚胎的初始质量的影响。72小时未附着的胚胎很可能无法存活。
在D8受精后（扩展培养的D3）...

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Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

在这里，我们描述了一种加热玻璃化人类胚胎的方法，通过体外植入期培养它们，将其消化成单细胞，并收集早期成体细胞，以作进一步研究。

近植入阶段人类胚胎中特罗福细胞的单细胞集合

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

许多怀孕在七、八个受精后人类胚胎发育的早期失败。该协议为调查人员提供了在这个神秘的植入窗口中体外生长人类概念体的机会。这使我们能够了解支撑人类植入成功和早期胎盘形成的机制。利用扩展的培养系统在体外生长植入阶段人类胚胎可能是获得真实材料研究植入和早期成体细胞分化的唯一方法。这种简单的技术是一个强大的工具，使我们能够回答许多有关人类早期发展的基本问题。使用本协议进行的研究将在很大程度上有助于了解早孕损失、反复植入失败和胎盘病理。演示这个程序的将是迪尔德雷·洛格斯登，一个实验室的博士生。胚胎变暖前一天，在无菌层流罩中准备介质和恢复板。用 10% SPS 填充两个中心井器官培养洗盘，用 500 微升 BM，然后用 500 微升的胚胎培养等级油覆盖 BM。在16毫米组织培养皿中，8毫升胚胎培养油层和锚定20微升BM滴，底部有10%的SPS。在37摄氏度、6%二氧化碳和5%氧气的培养箱中平衡洗碗液和回收板，至少4小时。将 IVC 1 的大约 4 毫升放入五毫升卡扣管中，并准备一个带 500 微升 IVC 1 的洗涤盘，无需油覆盖。将培养箱中的菜和管子平衡至少四个小时。在PBS中从人血清中稀释纤维素至每毫升30微克。打开八孔室盖玻片包装，注意不要接触井，然后轻轻地移液器250微升的纤维素进入每口井。更换盖玻片上的盖子，在 4 摄氏度下孵育 20 至 24 小时。在胚胎变暖的早晨准备扩展培养板。用纤维素取回室盖滑，并放在层流罩中。然后用一毫升移液器去除纤维素混合物并丢弃它。将平衡的 IVC 1 的移液 300 微升进入每个井，将盖玻片放入孵化器，直到去除 Zona pellucida。在D5人类胚胎的加热和恢复后，评估它们重新膨胀，并拍摄每个胚胎的照片。将每个胚胎移动到 5%FCS 缓冲处理介质的 500 微升。然后像文本手稿中描述的那样用酸性泰洛德的溶液来对待它。立即将胚胎与溶解的佐纳移动到300微升加热的莫普缓冲介质，以淬火泰洛德的溶液。然后将胚胎移动到中央井器官组织盘中，在胚胎培养品位油下含有10%SPS的均衡BM。然后将胚胎返回20微升恢复滴。使用平衡的 IVC 1 介质将胚胎单独移动到洗碗盘，然后小心地将每个胚胎移动到室盖玻片的井中，确保跟踪胚胎鉴定。将室盖玻片返回到37摄氏度、6%的二氧化碳和大气氧气的孵化器两天。在第二天，仔细检查胚胎在显微镜下的附着，并交换介质。通过轻轻敲击盘子，知道哪个胚胎附着在盘子上。要更换介质，请取下盖子，小心吸气 150 微升 IVC 1，注意不要打扰所附胚胎。如果胚胎尚未附着在板上，请勿更换介质，因为 IVC 1 中的血清有助于附着。缓慢移液器 150 微升的均衡扩展培养基，IVC 2 进入每个井，并更换盖玻片上的盖子。小心地将室盖玻片返回到孵化器。每天重复介质交换和附件检查，直到胚胎准备好固定或单细胞消化。如果需要收集已用介质进行进一步分析，请将去除的 IVC 1 的 150 微升卡冻结为无菌低束束 0.5 毫升管中。用200微升PBS清洗每个胚胎一次，然后向每个井中加入200微升的三辛解。将室盖玻片返回孵化器五分钟。使用小移液器或细拉嘴移液器拾起单个 MTB，然后使用较大的移液器通过上下吸气轻轻地分离胚胎。继续用直径较小的移液器尖端轻轻地反复吸气胚胎，直到胚胎在三辛中总共孵育10分钟。要进行单细胞选择，在胚胎培养油下通过320微升洗涤PBS和0.1%PVP的分离细胞，注意不要丢失任何细胞。洗涤后，使用精细拉玻璃移液器选择一个细胞。小心地将单个细胞移液到无菌的 0.2 毫升低结合管中，用最小容量的 PBS 和 PVP。在液氮中捕捉无自由单细胞，并将其储存在负80摄氏度，供进一步使用。健康的胚胎在扩展培养过程中继续扩散，而异常胚胎开始从外边缘缩回并解体。在受精后的第8天，胚胎中的大多数细胞是细胞萎缩细胞或CTB，对成体细胞标记GATA-3呈阳性。在胚胎的外围，CTB已经区分为多核同步细胞，有一个像外观和染色阳性的人类CGB的表。在第10天，CGB阳性候虫细胞的形成达到最大值，这一点得到了此时HCG生产激增的证实。对HLA-G有阳性的移栖细胞也开始出现，并远离胚胎体。到了第12天，STB分化正在下降，MTB的产生变得更加突出，这表明重点从第10天的激素生产转移到第12天的细胞迁移。这些变化可以在近植入期的时间推移视频中观察到。该视频演示了爆炸球的崩溃、STB 的形成以及 MTB 的最终分化和迁移。完成此过程时，要记住的最重要的事情是，您正在使用对温度、渗透性和 pH 值变化敏感的活胚胎。尽量减少盘子离开孵化器的时间对于维持胚胎健康至关重要。完成此程序后，研究人员可以使用分离的单细胞进行下游单细胞组理测定，如单细胞RNA测序和全基因组双硫拟合测序，以更好地了解人类植入和早期胎盘形成期间的表观遗传和转录变化。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

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