Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende de mange patienter på Colorado Center for Reproduktiv Medicin (CCRM), der har allernådigst doneret deres embryoner til forskning. Vi vil også gerne takke Karen Maruniak og det kliniske laboratorium på CCRM for deres hjælp til behandling af hCG prøver, samt Sue McCormick og hendes kliniske IVF embryologi team på CCRM for deres hjælp med embryo indsamling, opbevaring, sporing og donation. Finansieringen blev ydet internt af CCRM.

Alle menneskelige embryoner er blevet doneret med samtykke til brug i forskning. Protokollerne for udvidet menneskelig embryokultur er blevet godkendt af Western Institutional Review Board (undersøgelse nr. 1179872) og følger internationale retningslinjer. Enhver anvendelse af menneskelige embryoner skal gennemgås af de relevante etiske og styrende organer, der er tilknyttet forskningsinstitutionen ved hjælp af denne protokol.
1. Forberedelse
<ol><li>Forbered medier og nyttiggørelse pla...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

Udviklingen af protokollen til kultur menneskelige embryoner gennem implantation har gjort det muligt for forskere at udforske en tidligere ukendt tid i udvikling8,9. Her bruger vi et udvidet kultursystem til at dyrke menneskelige embryoner og studere tidlig trophoblast differentiering før dannelsen af villous placenta. De metoder, der er beskrevet her, giver os mulighed for at indsamle forskellige TB-underlinjer til brug i downstream-enkeltcelleanalyse. Dette a...

Human implantation og fremkomsten af den tidlige moderkagen er historisk vanskelige at undersøge og forbliver stort set ukendt, fordi humane væv er utilgængelige på dette tidspunkt, hvor graviditet er klinisk målbart. Dyremodeller er utilstrækkelige, da menneskelig placentisering har sine egne unikke egenskaber i forhold til andre euteriske pattedyr. For eksempel, menneskelige placenta invaderer dybt ind i decidua med nogle trophoblast celler nå mindst den indre tredjedel af livmoderen myometrium, mens andre celler omforme livmoderen spiral arterier. Selv vores nærmeste evolutionære forfædre, de ikke-menneskelige primater, viser forskelle i placenta morfologi og trophoblast interaktioner med moderensafgørende væv 1,,2,,3. Opnåelse af præimplantatation menneskelige embryoner in vitro var ikke muligt, før i 1980'erne, da klinisk human in vitro befrugtning (IVF) startede som en rutinemæssig praksis til behandling af infertilitet4. Nu kan menneskelige blastocyster dyrkes in vitro for at give mulighed for udvælgelse af mere levedygtige embryoner til overførsel, samt muliggøre sikker genetisk testning. Forbedring i embryo kultur teknikker, samt den stigende brug af IVF har givet mange overskydende blastocyster, som forbliver efter patientens behandling cykler er afsluttet. Med patientens samtykke, IRB godkendelse, og med visse restriktioner, disse blastocysts kan anvendes til forskningsundersøgelser. De er blevet en uvurderligressource,der blev brugt til afledning af menneskelige embryonale stamceller5, forståelse af overgangen af indre cellemasse til embryonale stamceller6,7, ogfor nylig, er blevet med succes dyrket indtil dag (D) 13 til remodel human implantation8,9. Ved at udnytte nyligt udviklede enkeltcelleomics tilgange, adgang til disse implantation fase menneskelige embryo væv har tilbudt unikke muligheder for at beskrive de molekylære mekanismer, der regulerer denne meget dynamisk celle differentiering proces, som tidligere var umuligt atudforske 10,11,12,13.
Her beskriver vi de metoder, der anvendes i vores seneste publikation, der karakteriserer dynamikken i trophoblast differentiering under menneskelig implantation12. Denne protokol omfatter opvarmning af forglasset blastocyster, udvidet embryokultur op til D12 post IVF, enzymatisk nedbrydning af embryonet i enkelte celler og celleindsamling til downstream-analyser (figur 1). Dette udvidede kultursystem understøtter peri-implantation fase menneskelige embryo udvikling uden moderens input og opsummerer trophoblast differentiering, der synes i overensstemmelse med observationer fra histologiske prøver mange årsiden 14,15,16,17. Under implantationen består trofoblastpopulationen af mindst to celletyper: den mononukleerede progenitorlignende cytotrophoblast (CTB) og den terminalt differentierede, flerkernede syncytiotrophoblast (STB). Ved trypsin fordøjelse, CTB er små, runde celler, der er morfologisk umulig at skelne fra andre celle slægter(Figur 2A,venstre panel). Adskillelse af CTB fra andre celle slægter, såsom epiblast og primitive endoderm, kan opnås ved deres særskilte transskriptive profiler afsløret ved enkeltcelle RNA sekventering. Syncytiotrophoblast celler kan let identificeres som uregelmæssige formede strukturer, der er betydeligt større end de andre celletyper og hovedsagelig placeret i periferien af fosteret (Figur 2A, midterste panel; Figur 2B, venstre panel). Migrerende trophoblast celler (MTB) er en anden trophoblast underlinje findes under embryo udvidet kultur og kan anerkendes som tilsyneladende bevæger sig væk fra hoveddelen af fosteret (Figur 2A, højre panel, Figur 2B, højre panel). Migrationstrophoblast bør, selv om den udtrykker mange af de samme markører som ekstra villous trophoblast (EVT), ikke betegnes som evt, da de villous strukturer i moderkagen ikke er opstået på dette meget tidlige udviklingsstadyd.
Eksperimentelt, vi var i stand til at indsamle små CTB og store STB, der er let skelnes efter embryoner er fordøjet i enkelte celler på D8, D10, og D12 (Figur 2A, B). Træktrophoblaster opstår på de senere stadier af den udvidede embryokultur og kan indsamles i D12, før hele fosterets enzymatiske fordøjelse (figur 2A,B). Ved fænopypisk at adskille disse tre trophoblast-underlinjer før enkeltcelleanalyse kan vi identificere specifikke transskriptionomiske markører og definere den biologiske rolle for hver celletype. Cytotrophoblast er meget proliferative og fungerer som progenitor celler i at levere STB og MTB differentieret slægter10,11,12,13. Syncytiotrophoblast er involveret i produktionen af placentahormoner for at opretholde graviditeten og kan også være ansvarlig for embryoner gravende ind i endometrium10,,11,,12,13. Vandrende trophoblast har endnu stærkere træk ved en invasiv, vandrende fænotype og er sandsynligvis ansvarlig for dybere og mere omfattende kolonisering af livmoderen endometrium10,11,12,13. Efter at have defineret den transskriptiske signatur for hver celletype har klyngeanalyser også afsløret yderligere to undergrupper af celler, der var morfologisk umulig at skelne fra CTB og havde transkriptiker med funktioner i STB og MTB,henholdsvis 12. Disse mellemliggende fase celler er sandsynligvis i færd med at differentiere fra CTB til enten MTB eller STB underlinjer og ville have været overset, hvis embryoner var blindt fordøjet og celler blev adskilt af transcriptome alene.
Den protokol, der er beskrevet her, anvender et todimensionelt (2D) kultursystem og er muligvis ikke optimal til at understøtte den tredimensionale (3D) strukturelle udvikling, som foreslået af en nylig publikation, der beskriver et nyudviklet 3D-kultursystem13. Ikke desto mindre synes differentieringen af tidlig trophoblast i dette 2D-system at være i overensstemmelse med observationer foretaget af in vivo-prøverne14,15,16,17. Denne protokol kan også let tilpasses til brug i det nyligt beskrevne 3D-kultursystem13 med minimale ændringer. Alle trin udføres med en håndholdt mikromanipulationpipette med kommercielt tilgængelige engangsspidser eller en mundpipette fra en finttrukket glaspipette fastgjort til gummislanger, et filter og et mundstykke.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

Menneskelig implantation, apposition og vedhæftning til livmoderoverfladen epithelia og efterfølgende invasion af blastocyst i moderen decidua, er en kritisk endnu gådefuld biologisk begivenhed, der har været historisk vanskeligt at studere på grund af tekniske og etiske begrænsninger. Implantation er initieret ved udvikling af trophectoderm til tidlig trophoblast og efterfølgende differentiering i forskellige trophoblast underlinjer. Afvigende tidlig trophoblast differentiering kan føre til implantation fiasko, placenta patologier, føtale abnormiteter, og abort. For nylig er der udviklet metoder til at tillade menneskelige embryoner at vokse indtil dag 13 efter befrugtning in vitro i mangel af maternel væv, en periode, der omfatter implantationsperioden hos mennesker. Dette har givet forskerne mulighed for at undersøge menneskelig implantation og opsummere dynamikken i trophoblast differentiering i denne kritiske periode uden at forvirre moderens påvirkninger og undgå iboende hindringer for at studere tidlige embryo differentiering begivenheder in vivo. For at karakterisere forskellige trophoblast-underlinjer under implantation har vi vedtaget eksisterende todimensionelle (2D) udvidede dyrkningsmetoder og udviklet en procedure til enzymatisk fordøje og isolere forskellige typer trophoblastceller til downstream-analyser. Embryoner dyrket under 2D-forhold har en relativt fladfræt morfologi og kan være suboptimale i modellering in vivo tre-dimensionelle (3D) embryonale arkitekturer. Trophoblast-differentiering synes imidlertid at være mindre påvirket, som det fremgår af forventede ændringer i morfologien og genekspressionen i løbet af den udvidede kultur. Forskellige trophoblast underlinjer, herunder cytotrophoblast, syncytiotrophoblast og vandrende trophoblast kan adskilles efter størrelse, placering, og tidsmæssige fremkomst, og bruges til yderligere karakterisering eller eksperimenter. Undersøgelse af disse tidlige trophoblast celler kan være medvirkende til at forstå menneskelig implantation, behandling af fælles placenta patologier, og afbøde forekomsten af graviditet tab.

Sunde embryoner udviste fortsat spredning i løbet af den udvidede kultur (figur 2B). Unormale embryoner begyndte at trække sig tilbage fra deres ydre kanter og opløses (Figur 2C). Fra vores erfaring, ca 75% af embryoner blev fastgjort til bunden af fibronectin belagt fad på 48 h og fastgørelse steg til ca 90% med 72 h i kultur. Succesen af embryo vedhæftet fil kan i vid udstrækning påvirket af den oprindelige kvalitet af blastocyster. Embryoner, der ikke...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Her beskriver vi en metode til opvarmning af forglasificerede menneskelige blastocysts, der dyrker dem gennem implantationsperioden in vitro, fordøjer dem i enkelte celler og indsamler tidlige trophoblastceller til yderligere undersøgelse.

Enkeltcellesamling af trophoblastceller i peri-implantationsstadium menneskelige embryoner

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Mange graviditeter mislykkes tidligt i menneskelige embryo udvikling omkring syv eller otte post-befrugtning. Denne protokol giver mulighed for at efterforskere til at vokse menneskelige conceptors in vitro under denne mystiske implantation vindue. Dette giver os mulighed for at forstå de mekanismer, der understøtter succesen af menneskelig implantation og tidlig placentadannelse.Ved hjælp af en udvidet kultur system til at vokse peri-implantation fase menneskelige embryoner in vitro er sandsynligvis den eneste måde at opnå autentiske materialer til at studere implantation og tidlig trophoblast differentiering. Denne enkle teknik er et kraftfuldt værktøj, der giver os mulighed for at besvare mange grundlæggende spørgsmål om menneskets tidlige udvikling. Forskning udført med brug af denne protokol vil i høj grad bidrage til forståelsen af tidlig graviditet tab, tilbagevendende implantation fiasko og moderkagen patologier.Demonstration af proceduren vil være Deirdre Logsdon, ph.d.-studerende fra et laboratorium. En dag før embryoopvarmning skal medie- og genvindingspladerne forberedes i en steril laminar flowhætte. Fyld to center godt orgel kultur vaske retter med 500 mikroliter af BM med 10% SPS, derefter dække BM med 500 mikroliter af embryo kultur grade olie.I en 16 millimeter vævskulturskål, lag otte milliliter embryokulturolie og forankring 20 mikroliterdråber af BM med 10% SPS til bunden. Ækvibrer vaskeskålen og genvindingspladen i en inkubator ved 37 grader Celsius, 6 % kuldioxid og 5 % ilt i mindst fire timer. Der tillægges ca. fire milliliter IVC 1 i et fem milliliter snap cap-rør, og der tilberedes en vaskeskål med 500 mikroliter IVC 1 uden olieoverlejring.Ligevægt skålen og røret i rugemaskinen i mindst fire timer. Fortyndet fibronectin fra humant serum i PBS til 30 mikrogram pr. milliliter. Åbn de otte godt chambered coverslip pakke passe på ikke at røre brøndene, derefter forsigtigt pipette 250 mikroliter af fibronectin i hver brønd.Sæt låget på dækslet ud og inkuber det ved fire grader Celsius i 20 til 24 timer. Forbered den udvidede kulturplade om morgenen af embryoopvarmning. Hent den chamberede dæksel slip med fibronectin og læg den i laminar flow hætten.Fjern derefter fibronectin blandingen med en milliliter pipette og kassér den. Pipette 300 mikroliter af de ligevægtede IVC 1 i hver brønd og placere dækslet i inkubatoren, indtil zona pellucida fjernes. Efter opvarmning og nyttiggørelse af D5 menneskelige embryoner, vurdere dem til re-ekspansion og tage billeder af hvert foster.Flyt hvert embryon til 500 mikroliter af et MOPS bufferhåndteringsmed 5% FCS. Behandl det derefter med sur tyrodens opløsning som beskrevet i tekstmanuskriptet. Flyt straks fosteret med opløsende zona i 300 mikroliter af opvarmet MOPS buffered medium til at slukke Tyrodens opløsning.Flyt derefter embryonet ind i en central brønd organvæv fad, der indeholder ækvilibrated BM med 10% SPS under embryo kultur grade olie. Derefter returneres fosteret til 20 mikroliter opsving dråbe. Flyt embryonerne individuelt til vaskeskålen med det ligevægtede IVC 1-medie, og flyt derefter forsigtigt hvert embryon til en brønd af den kammerdækslet, og sørg for at holde styr på embryoidentifikationen.Returner den chambered coverslip til en inkubator indstillet til 37 grader Celsius, 6% kuldioxid og atmosfærisk ilt i to dage. Ved udvækst dag to, omhyggeligt undersøge fastgørelse af embryoner under mikroskop og udveksle medierne. Vide, hvilket foster der er fastgjort til skålen ved forsigtigt at banke på pladen.Hvis du vil skifte medie, skal du fjerne låget og forsigtigt aspirere 150 mikroliter af IVC 1, idet du skal passe på ikke at forstyrre det påsatte embryo. Hvis et embryon endnu ikke er fastgjort til pladen, må mediet ikke udskiftes, da serummet i IVC 1 vil hjælpe med fastgørelse. Langsomt pipette 150 mikroliter af ækvilibrated udvidet kultur medier, IVC 2 i hver brønd og Udskift låget på coverslip.Forsigtigt returneres chambered coverslip til rugemaskinen. Gentag medieudveksling og kontrol af tilbehør hver dag, indtil embryonerne er klar til fiksering eller encellet fordøjelse. Hvis indsamling af brugt medie er nødvendig for yderligere analyse, fastfryses de 150 mikroliter af fjernet IVC 1 i et sterilt lavt binde 0,5 milliliterrør.Vask hvert embryon én gang med 200 mikroliter PBS, og tilsæt derefter 200 mikroliter trypsinopløsning til hver brønd. Vend den chamberede dækslæd på inkubatoren i fem minutter. Brug en lille pipette eller fint trukket mund pipette til at afhente en individuel MTB derefter bruge en større pipette til forsigtigt at adskille fosteret ved at aspirere op og ned.Fortsæt med at aspirere fosteret forsigtigt og gentagne gange med en pipettespids med mindre diameter, indtil embryonet er blevet inkuberet i i alt 10 minutter i trypsin. For at udføre enkelt celle udvælgelse, flytte de dissocierede celler gennem 320 mikroliter vaske dråber af PBS og 0,1% PVP under embryo kultur olie, passe på ikke at miste nogen celler. Efter vask cellerne bruge en fint trukket glas pipette til at vælge en celle.Pipetter forsigtigt enkeltcellen i et sterilt 0,2 milliliter lavbindingsrør med en minimal mængde PBS og PVP. Snap gratis enkelte celler i flydende nitrogen og gemme dem på negative 80 grader Celsius til videre brug. Sunde embryoner udviste fortsat spredning i løbet af den udvidede kultur, mens unormale embryoner begyndte at trække sig tilbage fra deres ydre kanter og gå i opløsning.På dag otte efter befrugtningen var de fleste celler i embryonerne cytotrophoblast eller CTBs, der var positive for trophoblast markør GATA-3. I periferien af fosteret, ctbs var allerede differentiere i multi-nucleated syncytiotrophoblasts, som havde et ark som udseende og farves positiv for mennesker CGB. På dag 10 var dannelsen af CGB-positive migrerende trophoblastceller på et maksimum, hvilket blev bekræftet af opblæsningen af HCG-produktionen på dette tidspunkt.Vandrende trophoblaster, som farves positiv for HLA-G, begyndte også at dukke op og migrere væk fra embryon kroppen. På dag 12 var STB-differentiering i tilbagegang, og MTB-produktionen blev mere fremtrædende, hvilket tyder på et skift i fokus fra hormonproduktion på dag 10 til cellemigration på dag 12. Disse ændringer kan observeres i en tidsforfald video af peri-implantation periode.Videoen viser sammenbruddet af blastocele, dannelsen af STB, og den endelige differentiering og migration af MTB. Det vigtigste at huske på, når du udfylder denne procedure er, at du arbejder med levende embryoner, der er følsomme over for ændringer i temperatur, osmolalitet og pH. Minimering af den tid, opvasken er ude af inkubatoren er afgørende for at opretholde embryo sundhed.Efter at have afsluttet denne procedure, kan efterforskere bruge isolerede enkelt celler til downstream enkelt celle omics assays, såsom enkelt celle RNA sekventering og hele genom bisulfit sekventering til bedre at forstå epigenetiske og transskriptionomic ændringer under human implantation og tidlig placenta dannelse.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering humane somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (IPSC&#39;er) under anvendelse af retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra humane somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...