Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

We willen graag de vele patiënten in het Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) die gracieus hun embryo's hebben gedoneerd voor onderzoek te erkennen. We willen ook Karen Maruniak en het klinisch laboratorium van CCRM bedanken voor hun hulp bij de verwerking van hCG-monsters, evenals Sue McCormick en haar klinische IVF-embryologieteam bij CCRM voor hun hulp bij het verzamelen, opslaan, volgen en doneren van embryo's. De financiering werd intern verstrekt door CCRM.

Alle menselijke embryo's zijn gedoneerd met toestemming voor gebruik in onderzoek. Protocollen voor uitgebreide menselijke embryocultuur zijn goedgekeurd door de Western Institutional Review Board (studie nr. 1179872) en volgen internationale richtlijnen. Elk gebruik van menselijke embryo's moet worden beoordeeld door de juiste ethische en bestuursorganen die aan de onderzoeksinstelling zijn gekoppeld aan het gebruik van dit protocol.
1. Voorbereiding
<ol><li>Bereid media en herstelplaten ee...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

De ontwikkeling van het protocol voor de cultuur van menselijke embryo's door middel van implantatie heeft wetenschappers in staat gesteld om een niet eerder in kaart gebrachte tijd in ontwikkeling8,9te verkennen . Hier gebruiken we een uitgebreid cultuursysteem om menselijke embryo's te verkleven en bestuderen we vroege trofoblastdifferentiatie vóór de vorming van villous placenta. De hier beschreven methoden stellen ons in staat om verschillende TB-sublineage...

Menselijke implantatie en de opkomst van de vroege placenta zijn historisch moeilijk te onderzoeken en blijven grotendeels onbekend omdat menselijke weefsels ontoegankelijk zijn in dit stadium wanneer de zwangerschap klinisch niet op te sporen is. Diermodellen zijn ontoereikend, omdat menselijke placentatie zijn eigen unieke eigenschappen heeft in vergelijking met andere eutherische zoogdieren. Bijvoorbeeld, menselijke placenta binnendringt diep in de decidua met een aantal trofoblastcellen het bereiken van ten minste het binnenste derde van de baarmoeder myometrium, terwijl andere cellen remodelleren de baarmoeder spiraalslagaders. Zelfs onze naaste evolutionaire voorouders, de niet-menselijke primaten, vertonen verschillen in placentamorfologie en trofoblast interacties met de moederdeciduele weefsels1,,2,3. Het verkrijgen van pre-implantatie menselijke embryo's in vitro was niet mogelijk tot in de jaren 1980 toen klinische menselijke in vitro fertilisatie (IVF) begon als een routinepraktijk voor de behandeling van onvruchtbaarheid4. Nu kunnen menselijke blastocysten in vitro worden gekweekt om de selectie van meer levensvatbare embryo's voor overdracht mogelijk te maken, evenals veilige genetische tests mogelijk te maken. Verbetering van de embryocultuur technieken, evenals het toenemende gebruik van IVF heeft geleid tot veel overtollige blastocysten die overblijft na de behandeling van de patiënt cycli zijn voltooid. Met toestemming van de patiënt, IRB goedkeuring, en met bepaalde beperkingen, kunnen deze blastocysten worden gebruikt voor onderzoeken. Ze zijn uitgegroeid tot een onschatbare hulpbron die werden gebruikt voor de afleiding van menselijke embryonale stamcellen5, inzicht in de overgang van de innerlijke celmassa naar embryonale stamcellen6,7, en meer recentelijk, zijn met succes gekweekt tot dag (D) 13 om menselijke implantatie te verbouwen8,9. Door gebruik te maken van recent ontwikkelde eencellige omics benaderingen, heeft de toegang tot deze implantatiefase menselijke embryoweefsels unieke mogelijkheden geboden om de moleculaire mechanismen te beschrijven die dit zeer dynamische celdifferentiatieproces reguleren, dat voorheen onmogelijk was om10,11,12,13te verkennen .
Hier beschrijven we de methoden die in onze recente publicatie worden gebruikt en karakteriseren we de dynamiek van trofoblastdifferentiatie tijdens menselijke implantatie12. Dit protocol omvat de opwarming van verglaasde blastocysten, uitgebreide embryocultuur tot D12 na IVF, enzymatische vertering van het embryo in enkele cellen en celverzameling voor downstream-tests(figuur 1). Dit uitgebreide kweeksysteem ondersteunt de ontwikkeling van peri-implantatiefase menselijke embryo's zonder maternale input en recapituleert trofoblastdifferentiatie die in overeenstemming lijkt met de waarnemingen van histologische specimens vele jaren geleden14,15,16,17. Tijdens de implantatie bestaat de trofoblastpopulatie uit ten minste twee celtypen: de mononucleated progenatorachtige cytotrophoblast (CTB) en de terminaal gedifferentieerde, multinucleated syncytiotrophoblast (STB). Bij trypsine spijsvertering, de CTB zijn kleine, ronde cellen die morfologisch niet te onderscheiden zijn van andere cellijnen (Figuur 2A, linker paneel). Scheiding van CTB van andere cellijnen, zoals epiblast en primitief endoderm, kan worden bereikt door hun verschillende transcriptomische profielen onthuld door single cell RNA sequencing. Syncytiotrophoblastcellen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als onregelmatige gevormde structuren die aanzienlijk groter zijn dan de andere celtypen en zich voornamelijk bevinden aan de periferie van het embryo(figuur 2A, middenpaneel; Figuur 2B, linkerpaneel). Trekkende trofoblastcellen (MTB) zijn een andere trofoblast sublineage gevonden tijdens embryo uitgebreide cultuur en kan worden herkend als schijnbaar weg van het hoofdlichaam van het embryo (Figuur 2A, rechter paneel, Figuur 2B, rechter paneel). Migrerende trofoblast, hoewel het uitdrukken van veel van dezelfde markers als extra villous trofoblast (EVT), mag niet worden aangeduid als EVT, omdat de villous structuren in de placenta niet zijn ontstaan in dit zeer vroege stadium van ontwikkeling.
Experimenteel konden we kleine CTB en grote STB verzamelen die gemakkelijk te onderscheiden zijn nadat embryo's zijn verteerd tot enkele cellen bij D8, D10 en D12(figuur 2A,B). Trekkende trofoblasten ontstaan in de latere stadia van uitgebreide embryocultuur en kunnen bij D12 worden verzameld vóór enzymatische vertering van het hele embryo (figuur 2A,B). Door feotisch deze drie trofoblast sublineages te scheiden voor eencellige analyse, kunnen we specifieke transcriptomische markers identificeren en de biologische rol van elk celtype definiëren. Cytotrophoblast zijn zeer proliferative en fungeren als voorloper cellen in de levering van de STB en MTB gedifferentieerde afstammingen10,11,12,13. Syncytiotrophoblast zijn betrokken bij de productie van placentahormonen om de zwangerschap te handhaven en kan ook verantwoordelijk zijn voor de embryo's graven in het endometrium10,11,12,13. Trekkende trofoblast heeft nog sterkere kenmerken van een invasief, migrerend fenotype en zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor een diepere en uitgebreidere kolonisatie van het baarmoeder- endometrium10,11,12,13. Na het definiëren van de transcriptomische handtekening van elk celtype, clustering analyses hebben ook twee extra subsets van cellen die morfologisch niet te onderscheiden van CTB en had transcriptomen met kenmerken van STB en MTB, respectievelijk12. Deze tussenstadiumcellen zijn waarschijnlijk in het proces van het differentiëren van CTB aan of de sublineages MTB of STB en zouden over het hoofd gezien zijn als de embryo's blind werden verteerd en de cellen door transcriptoom alleen werden gescheiden.
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een tweedimensionaal (2D) cultuursysteem en is mogelijk niet optimaal voor het ondersteunen van driedimensionale (3D) structurele ontwikkeling, zoals wordt gesuggereerd door een recente publicatie waarin een nieuw ontwikkeld 3D-cultuursysteem13wordt beschreven. Niettemin lijkt de differentiatie van vroege trofoblast in dit 2D-systeem in overeenstemming te zijn met waarnemingen van in vivo specimens14,15,16,17. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast voor het gebruik in het onlangs beschreven 3D-cultuursysteem13 met minimale wijzigingen. Alle stappen worden uitgevoerd met een handheld micromanipulatie pipet met commercieel verkrijgbare wegwerptips of een mondpipet van een fijn getrokken glazen pipet aan rubberen buizen, een filter en een mondstuk.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

Menselijke implantatie, de apposition en hechting aan het baarmoederoppervlak epithelia en de daaropvolgende invasie van de blastocyst in de moeder decidua, is een kritische maar raadselachtige biologische gebeurtenis die historisch moeilijk te bestuderen als gevolg van technische en ethische beperkingen. Implantatie wordt geïnitieerd door de ontwikkeling van het trophectoderm tot vroege trofoblast en de daaropvolgende differentiatie in verschillende trofoblast sublineages. Afwijkende vroege trofoblast differentiatie kan leiden tot implantatie falen, placentapathologieën, foetale afwijkingen, en miskraam. Onlangs zijn methoden ontwikkeld om menselijke embryo's te laten groeien tot dag 13 na de bevruchting in vitro bij afwezigheid van moederweefsels, een periode die de implantatieperiode bij de mens omvat. Dit heeft onderzoekers de mogelijkheid gegeven om menselijke implantatie te onderzoeken en de dynamiek van trofoblastdifferentiatie tijdens deze kritieke periode samen te vatten zonder moederinvloeden te verwarren en inherente obstakels te vermijden om vroege embryodifferentiatiegebeurtenissen in vivo te bestuderen. Om verschillende trofoblast sublinages te karakteriseren tijdens implantatie, hebben we bestaande tweedimensionale (2D) uitgebreide kweekmethoden aangenomen en een procedure ontwikkeld om verschillende soorten trofoblastcellen enzymatisch te verteren en te isoleren voor downstream-testen. Embryo's gekweekt in 2D-omstandigheden hebben een relatief afgeplatte morfologie en kunnen suboptimaal zijn in het modelleren in vivo driedimensionale (3D) embryonale architecturen. Echter, trofoblast differentiatie lijkt minder worden beïnvloed, zoals blijkt uit de verwachte morfologie en genexpressie veranderingen in de loop van de uitgebreide cultuur. Verschillende trofoblast sublineages, met inbegrip van cytotrophoblast, syncytiotrophoblast en trekkende trofoblast kan worden gescheiden door grootte, locatie, en temporele opkomst, en gebruikt voor verdere karakterisering of experimenten. Onderzoek van deze vroege trofoblastcellen kan een instrument zijn om menselijke implantatie te begrijpen, gemeenschappelijke placentapathologieën te behandelen en de incidentie van zwangerschapsverlies te verzachten.

Gezonde embryo's vertoonden een voortdurende proliferatie in de loop van de uitgebreide cultuur(figuur 2B). Abnormale embryo's begonnen zich van hun buitenste randen terug te trekken en uiteen te vallen(figuur 2C). Uit onze ervaring, ongeveer 75% van de embryo's werden bevestigd aan de onderkant van de fibronectin gecoate schotel op 48 uur en de gehechtheid steeg tot ongeveer 90% door 72 h in de cultuur. Het succes van embryo-gehechtheid kan grotendeels worden b...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.

Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Veel zwangerschappen mislukken vroeg in de ontwikkeling van menselijke embryo's rond de zeven of acht post-bevruchting. Dit protocol biedt mogelijkheden voor onderzoekers om menselijke conceptors in vitro te laten groeien tijdens dit mysterieuze implantatievenster. Dit stelt ons in staat om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan het succes van menselijke implantatie en vroege placentavorming.Het gebruik van een uitgebreid kweeksysteem om peri-implantatiefase menselijke embryo's in vitro te laten groeien is waarschijnlijk de enige manier om authentieke materialen te verkrijgen om implantatie en vroege trofoblastdifferentiatie te bestuderen. Deze eenvoudige techniek is een krachtig instrument dat ons in staat stelt om veel fundamentele vragen over de menselijke vroege ontwikkeling te beantwoorden. Onderzoek uitgevoerd met het gebruik van dit protocol zal grotendeels bijdragen aan het begrip van vroegtijdig zwangerschapsverlies, terugkerend implantatiefalen en de placentapathologieën.Het aantonen van de procedure zal Deirdre Logsdon, de promovendus uit een laboratorium. Een dag voor de opwarming van het embryo, de voorbereiding van de media en herstel platen in een steriele laminaire flow hood. Vul twee centrum goed orgaancultuur wasgerechten met 500 microliters van BM met 10%SPS, dan bedekken de BM met 500 microliters van embryo cultuur kwaliteit olie.In een 16 millimeter weefsel kweekschotel, laag acht milliliter embryo kweekolie en anker 20 microliter druppels BM met 10% SPS naar de bodem. Equilibrate de wasschotels en herstelplaat in een couveuse op 37 graden Celsius, 6%kooldioxide en 5% zuurstof gedurende ten minste vier uur. Aliquot ongeveer vier milliliter van IVC 1 in een vijf milliliter snap cap buis en bereiden een wasschaal met 500 microliters van IVC 1 zonder olie overlay.Equilibrate de schotel en buis in de couveuse voor ten minste vier uur. Verdun fibronectine uit menselijk serum in PBS tot 30 microgram per milliliter. Open de acht goed chambered coverslip pakket zorg ervoor dat de putten niet aan te raken, dan voorzichtig pipette 250 microliters van de fibronectin in elke put.Vervang het deksel op de coverlip en broed het 20 tot 24 uur op vier graden Celsius. Bereid de uitgebreide kweekplaat voor op de ochtend van de opwarming van het embryo. Haal de chambered cover slip met fibronectin en plaats het in de laminaire stroomkap.Verwijder vervolgens het fibronectinemengsel met een pipet van één milliliter en gooi het weg. Pipette 300 microliters van de geëquilibreerde IVC 1 in elke put en plaats de coverslip in de couveuse tot verwijdering van de zona pellucida. Na opwarming en herstel van de D5 menselijke embryo's, beoordeel ze voor re-expansie en neem foto's van elk embryo.Verplaats elk embryo naar 500 microliters van een MOPS gebufferd handling medium met 5% FCS. Behandel het dan met de zure Tyrode's oplossing zoals beschreven in het tekstmanuscript. Verplaats het embryo met de oplossende zona onmiddellijk in 300 microliter van opgewarmd MOPS gebufferd medium om de oplossing van de Tyrode te doven.Verplaats het embryo vervolgens in een centrale putorgaanweefselschotel met de geëquilibreerde BM met 10%SPS onder de embryocultuurkwaliteitsolie. Breng het embryo vervolgens terug naar de herstelval van 20 microliter. Beweeg de embryo's individueel naar de wasschaal met de geëquilibreerde IVC 1-media en verplaats elk embryo vervolgens zorgvuldig naar een put van de chambered coverslip, om de embryo-identificatie bij te houden.Breng de chambered coverslip terug naar een couveuse die twee dagen lang is ingesteld op 37 graden Celsius, 6%koolstofdioxide en atmosferische zuurstof. Op uitgroei dag twee, zorgvuldig onderzoeken van de bevestiging van de embryo's onder de microscoop en de media uit te wisselen. Weet welk embryo aan de schotel is bevestigd door zachtjes op de plaat te tikken.Om de media te veranderen, verwijder het deksel en zorgvuldig aspirate 150 microliter van IVC 1, zorg ervoor dat het bijgevoegde embryo niet storen. Als een embryo nog niet aan de plaat is bevestigd, wissel dan de media niet uit omdat het serum in IVC 1 zal helpen bij het bevestigen. Langzaam pipette 150 microliters van geëquilibreerde uitgebreide cultuur media, IVC 2 in elke put en Vervang het deksel op de coverslip.De chambered coverslip voorzichtig teruggegeven aan de couveuse. Herhaal media-uitwisseling en bijlage controleren elke dag totdat embryo's klaar zijn voor fixatie of eencellige spijsvertering. Als het verzamelen van gebruikte media nodig is voor verdere analyse, snap bevriezen van de 150 microliter van verwijderdE IVC 1 in een steriele lage binding 0,5 milliliter buis.Was elk embryo eenmaal met 200 microliter PBS en voeg vervolgens 200 microliter trypsineoplossing toe aan elke put. Breng de chambered coverslip gedurende vijf minuten terug naar de couveuse. Gebruik een kleine pipet of fijn getrokken mondpipet op te halen een individuele MTB gebruik dan een grotere pipet om voorzichtig te scheiden van het embryo door aspirating op en neer.Blijf het embryo voorzichtig en herhaaldelijk met behulp van een kleinere diameter pipet tip totdat het embryo is geïncubeerd voor een totaal van 10 minuten in trypsine. Om eencellige selectie uit te voeren, verplaatst u de gescheiden cellen door 320 microliter wasdruppels PBS en 0,1% PVP onder embryocultuurolie, waarbij u ervoor moet zorgen dat er geen cellen verloren gaan. Na het wassen van de cellen gebruik maken van een fijn getrokken glazen pipet om een cel te selecteren.Voorzichtig pipette de enkele cel in een steriele 0,2 milliliter lage bindbuis met een minimaal volume PBS en PVP. Snap gratis enkele cellen in vloeibare stikstof en bewaar ze op negatieve 80 graden Celsius voor verder gebruik. Gezonde embryo's vertoonden aanhoudende proliferatie in de loop van de uitgebreide kweek, terwijl abnormale embryo's zich van hun buitenste randen begonnen terug te trekken en uiteen te vallen.Op dag acht na de bevruchting waren de meeste cellen in de embryo's cytotrophoblast of CTB's, die positief waren voor trofoblastmarker GATA-3. Aan de periferie van het embryo, waren de CTB's al onderscheiden in multi-nucleated syncytiotrophoblasten, die een blad achtige verschijning en gekleurd positief voor de mens CGB had. Op dag 10 was de vorming van CGB-positieve trekkende trofoblastcellen maximaal, wat werd bevestigd door de toename van de HCG-productie op dit moment.Trekkende trofoblasten die positief gekleurd voor HLA-G, ook begon te ontstaan en migreren uit de buurt van het embryo lichaam. Door dag 12, STB differentiatie was in verval en MTB productie werd meer prominent, wat wijst op een verschuiving van de nadruk van hormoonproductie op dag 10 naar celmigratie op dag 12. Deze veranderingen kunnen worden waargenomen in een time lapse video van de peri-implantatieperiode.De video toont de ineenstorting van de blastocele, de vorming van de STB, en de uiteindelijke differentiatie en migratie van MTB. Het belangrijkste om in gedachten te houden bij het voltooien van deze procedure is dat je werkt met levende embryo's die gevoelig zijn voor veranderingen in temperatuur, osmolaliteit en pH. Het minimaliseren van de hoeveelheid tijd dat de gerechten uit de couveuse zijn, is van cruciaal belang voor het behoud van de gezondheid van embryo's.Na het voltooien van deze procedure kunnen onderzoekers geïsoleerde enkele cellen gebruiken voor downstream eencellige omics-tests, zoals eencellige RNA-sequencing en hele genoombiulfie sequencing om epigenetische en transcriptische veranderingen tijdens menselijke implantatie en vroege placentavorming beter te begrijpen.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo&#39;s

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Het plaatsen van Growth Factor-Coated Kralen op Early Stage kippenembryo&#39;s

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryo&#39;s

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

Single Cell Transfectie in kippenembryo&#39;s

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cel Vorm wijzigen in Living Drosophila Embryo&#39;s

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo&#39;s

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...