Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Wir möchten die vielen Patienten am Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) würdigen, die ihre Embryonen gnädig für die Forschung gespendet haben. Wir danken auch Karen Maruniak und dem klinischen Labor am CCRM für ihre Hilfe bei der Verarbeitung von hCG-Proben sowie Sue McCormick und ihrem klinischen IVF-Embryologie-Team bei CCRM für ihre Hilfe bei der Sammlung, Lagerung, Verfolgung und Spende von Embryonen. Die Finanzierung erfolgte intern durch CCRM.

Alle menschlichen Embryonen wurden mit Zustimmung zur Verwendung in der Forschung gespendet. Protokolle für eine erweiterte menschliche Embryokultur wurden vom Western Institutional Review Board (Studie Nr. 1179872) genehmigt und folgen internationalen Richtlinien. Jede Verwendung menschlicher Embryonen muss von den zuständigen Ethik- und Leitungsgremien überprüft werden, die mit der Forschungseinrichtung unter Verwendung dieses Protokolls verbunden sind.
1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

Die Entwicklung des Protokolls zur Kultur menschlicher Embryonen durch Implantation hat es Wissenschaftlern ermöglicht, eine bisher unbekannte Entwicklungszeit zu erforschen8,9. Hier verwenden wir ein erweitertes Kultursystem, um menschliche Embryonen zu kultivieren und die frühe Trophoblastendifferenzierung vor der Bildung einer villous Plazenta zu untersuchen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen es uns, verschiedene TB-Unterlinien für die Nachfluss-...

Die menschliche Implantation und die Entstehung der frühen Plazenta sind historisch schwer zu untersuchen und bleiben weitgehend unbekannt, da menschliche Gewebe in diesem Stadium, in dem eine Schwangerschaft klinisch nicht nachweisbar ist, unzugänglich sind. Tiermodelle sind unzureichend, da die menschliche Platierweise ihre eigenen Einzigartigen im Vergleich zu anderen eutherischen Säugetieren hat. Zum Beispiel dringt die menschliche Plazenta tief in die Dezidua ein, wobei einige Trophoblastenzellen mindestens das innere Drittel des Uterusmyometriums erreichen, während andere Zellen die Gebärmutterspiralarterien umgestalten. Selbst unsere nächsten evolutionären Vorfahren, die nichtmenschlichen Primaten, zeigen Unterschiede in der plazentatren Morphologie und trophoblastischen Wechselwirkungen mit den mütterlichen deziduellen Geweben1,2,3. Die Beschaffung von vorderimplantationen menschlichen Embryonen in vitro war erst in den 1980er Jahren möglich, als die klinische menschliche In-vitro-Fertilisation (IVF) als Routinepraxis zur Behandlung von Unfruchtbarkeit begann4. Jetzt können menschliche Blastozysten in vitro angebaut werden, um die Auswahl lebensfähigerer Embryonen für den Transfer zu ermöglichen und sichere genetische Tests zu ermöglichen. Die Verbesserung der Embryokulturtechniken sowie der zunehmende Einsatz von IVF haben zu vielen überschüssigen Blastozysten geführt, die nach Abschluss der Behandlungszyklen des Patienten erhalten geblieben sind. Mit Zustimmung des Patienten, IRB-Zulassung, und mit bestimmten Einschränkungen, Diese Blastozysten können für Forschungsstudien verwendet werden. Sie sind zu einer unschätzbaren Ressource geworden, die für die Ableitung menschlicher embryonaler Stammzellen verwendet wurde5, das Verständnis des Übergangs der inneren Zellmasse zu embryonalen Stammzellen6,7, und in jüngerer Zeit, wurden erfolgreich bis zum Tag (D) 13 kultiviert, um die menschliche Implantationumzugestalten 8,9. Durch die Verwendung von kürzlich entwickelten einzelzelligen Omics-Ansätzen bietet der Zugang zu diesen implantationsphase menschlichen Embryogeweben einzigartige Möglichkeiten, die molekularen Mechanismen zu beschreiben, die diesen hochdynamischen Zelldifferenzierungsprozess regulieren, die bisher unmöglich zu erforschen waren10,11,12,13.
Hier beschreiben wir die Methoden, die in unserer jüngsten Publikation verwendet werden, die die Dynamik der Trophoblastendifferenzierung während der menschlichen Implantation12charakterisiert. Dieses Protokoll umfasst die Erwärmung verglaster Blastozysten, die erweiterte Embryokultur bis D12 nach DerIVF, die enzymatische Verdauung des Embryos in einzelne Zellen und die Zellentnahme für nachgeschaltete Assays (Abbildung 1). Dieses erweiterte Kultursystem unterstützt die Entwicklung des peri-implantationsstadiums menschlicher Embryonen ohne mütterlichen Input und rekapituliert die Trophoblastendifferenzierung, die mit den Beobachtungen aus histologischen Proben vor vielen Jahrenübereinstimmt 14,15,16,17. Während der Implantation besteht die Trophoblastenpopulation aus mindestens zwei Zelltypen: dem mononukleierten Vorläufer-ähnlichen Zytotrophoblasten (CTB) und dem endlos differenzierten, multinukleierten Synzytiotrophoblast (STB). Bei der Trypsinverdauung sind die CTB kleine, runde Zellen, die morphologisch nicht von anderen Zelllinien zu unterscheiden sind(Abbildung 2A, linkes Panel). Die Trennung von CTB von anderen Zelllinien, wie Epiblast und primitivem Endoderm, kann durch ihre unterschiedlichen transkriptomischen Profile erreicht werden, die durch einzellige RNA-Sequenzierung aufgedeckt werden. Syncytiotrophoblast-Zellen können leicht als unregelmäßig geformte Strukturen identifiziert werden, die deutlich größer als die anderen Zelltypen sind und sich hauptsächlich an der Peripherie des Embryos befinden(Abbildung 2A, mittleres Panel; Abbildung 2B, linkes Bedienfeld). Migratory trophoblast cells (MTB) are another trophoblast sublineage found during embryo extended culture and can be recognized as apparently moving away from the main body of the embryo (Abbildung 2A, rechtes Panel, Abbildung 2B, rechtes Panel). Migrierender Trophoblast, obwohl er viele der gleichen Marker wie extra villous trophoblast (EVT) ausdrückt, sollte nicht als EVT bezeichnet werden, da die villous Strukturen in der Plazenta in diesem sehr frühen Entwicklungsstadium nicht entstanden sind.
Experimentell konnten wir kleine CTB und große STB sammeln, die leicht zu unterscheiden sind, nachdem Embryonen in einzelnen Zellen bei D8, D10 und D12 verdaut wurden (Abbildung 2A,B). Wandernde Trophoblasten entstehen in den späteren Stadien der erweiterten Embryokultur und können bei D12 vor der enzymatischen Verdauung des gesamten Embryos gesammelt werden (Abbildung 2A,B). Durch phäotypische Trennung dieser drei Trophoblasten-Unterlinien vor der Einzelzellanalyse können wir spezifische transkriptomische Marker identifizieren und die biologische Rolle jedes Zelltyps definieren. Cytotrophoblast sind hoch proliferativ und fungieren als Vorläuferzellen bei der Versorgung der STB und MTB differenzierten Linien10,11,12,13. Syncytiotrophoblast sind an der Herstellung von Plazentahormonen zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft beteiligt und können auch für die Embryonen verantwortlich sein, die sich in das Endometrium10,,11,12,13graben. Wandernder Trophoblast hat noch stärkere Merkmale eines invasiven, wandernden Phänotyps und ist wahrscheinlich für eine tiefere und umfassendere Besiedlung des Uterusendometriums10,11,12,13verantwortlich. Nach der Definition der transkriptomischen Signatur jedes Zelltyps haben Clustering-Analysen auch zwei zusätzliche Teilmengen von Zellen aufgedeckt, die morphologisch nicht von CTB zu unterscheiden waren und Transkriptome mit Merkmalen von STB und MTB bzw.12hatten. Diese Zwischenstadiumzellen sind wahrscheinlich dabei, sich von CTB auf die MTB- oder STB-Unterlinien zu differenzieren und wären übersehen worden, wenn Embryonen blind verdaut und Zellen allein durch Transkriptom getrennt worden wären.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein zweidimensionales (2D) Kultursystem und ist möglicherweise nicht optimal für die Unterstützung der dreidimensionalen (3D) strukturellen Entwicklung, wie eine kürzlich erschienene Veröffentlichung zur Beschreibung eines neu entwickelten 3D-Kultursystems13. Dennoch scheint in diesem 2D-System die Differenzierung des frühen Trophoblasten mit Beobachtungen aus in vivo Proben14,15,16,17vereinbar zu sein. Dieses Protokoll kann auch leicht für den Einsatz im kürzlich beschriebenen 3D-Kultursystem13 mit minimalen Änderungen angepasst werden. Alle Schritte werden mit einer handgeführten Mikromanipulationspipette mit handelsüblichen Einwegspitzen oder einer Mundpipette aus einer fein gezogenen Glaspipette durchgeführt, die an Gummischläuchen, einem Filter und einem Mundstück befestigt ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

Die menschliche Implantation, die Apposition und Haftung an der Gebärmutteroberflächenepithelie und die anschließende Invasion der Blastozyste in die mütterliche Dekliste, ist ein kritisches, aber rätselhaftes biologisches Ereignis, das aufgrund technischer und ethischer Einschränkungen historisch schwierig zu untersuchen war. Die Implantation wird durch die Entwicklung des Trophektoderms zu frühen Trophoblasten und die anschließende Differenzierung in unterschiedliche Trophoblasten-Unterlinien eingeleitet. Aberrante frühe Trophoblastendifferenzierung kann zu Implantationsversagen, Plazentapathologien, fetalen Anomalien und Fehlgeburten führen. Kürzlich wurden Methoden entwickelt, die es menschlichen Embryonen ermöglichen, bis zum Tag 13 nach der Befruchtung in vitro in Abwesenheit von mütterlichem Gewebe zu wachsen, eine Zeit, die die Implantationszeit beim Menschen umfasst. Dies hat den Forschern die Möglichkeit gegeben, die menschliche Implantation zu untersuchen und die Dynamik der Trophoblastendifferenzierung während dieser kritischen Periode zu rekapitulieren, ohne mütterliche Einflüsse zu verwirren und inhärente Hindernisse zu vermeiden, um frühe Embryodifferenzierungsereignisse in vivo zu untersuchen. Um verschiedene Trophoblast-Unterlinien während der Implantation zu charakterisieren, haben wir bestehende zweidimensionale (2D) erweiterte Kulturmethoden übernommen und ein Verfahren entwickelt, um verschiedene Arten von Trophoblastenzellen für nachgeschaltete Assays enzymatisch zu verdauen und zu isolieren. Embryonen, die in 2D-Bedingungen kultiviert werden, haben eine relativ abgeflachte Morphologie und können suboptimal bei der Modellierung dreidimensionaler (3D) embryonaler Architekturen in vivo sein. Die Trophoblastendifferenzierung scheint jedoch weniger betroffen zu sein, wie die erwarteten Veränderungen der Morphologie und der Genexpression im Laufe der erweiterten Kultur zeigen. Verschiedene Trophoblast-Unterlinien, einschließlich Cytotrophoblast, Synzytiotrophoblast und migratorischer Trophoblasten, können durch Größe, Position und zeitliche Entstehung getrennt und für weitere Charakterisierungen oder Experimente verwendet werden. Die Untersuchung dieser frühen Trophoblastenzellen kann entscheidend zum Verständnis der menschlichen Implantation, zur Behandlung von häufigen Plazentapathologien und zur Milderung der Inzidenz von Schwangerschaftsverlusten beitragen.

Gesunde Embryonen zeigten im Laufe der erweiterten Kultur eine anhaltende Proliferation (Abbildung 2B). Abnorme Embryonen begannen, sich von ihren äußeren Rändern zurückzuziehen und zerfallen (Abbildung 2C). Aus unserer Erfahrung wurden ca. 75% der Embryonen bei 48 h am Boden der fibronectinbeschichteten Schale befestigt und die Anhaftung stieg in der Kultur um ca. 90% um 72 h an. Der Erfolg der Embryo-Anhaftung kann weitgehend durch die anfängliche Qualit?...

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Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Viele Schwangerschaften scheitern früh in der entwicklung menschlicher Embryonen um die sieben oder acht Nachbefruchtung. Dieses Protokoll bietet den Forschern die Möglichkeit, während dieses mysteriösen Implantationsfensters menschliche Konzeptoren in vitro zu entwickeln. Dies ermöglicht es uns, die Mechanismen zu verstehen, die den Erfolg der menschlichen Implantation und frühen Plazentabildung untermauern.Die Verwendung eines erweiterten Kultursystems zum Anbau von peri-implantationsweichen menschlichen Embryonen in vitro ist wahrscheinlich die einzige Möglichkeit, authentische Materialien zu erhalten, um Implantation und frühe Tropoblastdifferenzierung zu untersuchen. Diese einfache Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das es uns ermöglicht, viele grundlegende Fragen über die frühe Entwicklung des Menschen zu beantworten. Forschung mit der Verwendung dieses Protokolls durchgeführt wird weitgehend zum Verständnis des frühen Schwangerschaftsverlusts, wiederkehrendeim implantationsversagen und der Plazentapathologien beitragen.Demonstriert wird das Verfahren von Deirdre Logsdon, dem Doktoranden eines Labors. Einen Tag vor der Erwärmung des Embryos bereiten Sie Medien und Rückgewinnungsplatten in einer sterilen laminaren Strömungshaube vor. Füllen Sie zwei Zentrum gut OrganKultur Waschgerichte mit 500 Mikroliter BM mit 10%SPS, dann decken Sie die BM mit 500 Mikroliter embryo Kultur Grade Öl.In einer 16-Millimeter-Gewebekulturschale acht Milliliter Embryokulturöl schichten und 20 Mikroliter-Tropfen BM mit 10% SPS nach unten verankern. Gleichgewichten Sie die Waschschüsseln und die Rückgewinnungsplatte in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, 6% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff für mindestens vier Stunden. Aliquot etwa vier Milliliter IVC 1 in einem Fünf-Milliliter-Snap-Cap-Rohr und bereiten Sie eine Waschschale mit 500 Mikroliter IVC 1 ohne Öl-Overlay zu.Die Schale und die Tube im Inkubator mindestens vier Stunden ausdemaieren. Fibronectin aus menschlichem Serum in PBS auf 30 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Öffnen Sie die acht gut gekammerten Coverslip-Paket mit Pflege nicht die Brunnen berühren, dann sanft Pipette 250 Mikroliter des Fibronectin in jedem Brunnen.Ersetzen Sie den Deckel auf dem Deckel und inkubieren Sie ihn bei vier Grad Celsius für 20 bis 24 Stunden. Bereiten Sie die erweiterte Kulturplatte am Morgen der Embryoerwärmung vor. Holen Sie den kammerierten Deckelschlupf mit Fibronectin und legen Sie ihn in die laminare Strömungshaube.Dann entfernen Sie die Fibronectin-Mischung mit einer Ein-Milliliter-Pipette und entsorgen Sie sie. 300 Mikroliter des ausgeglichenen IVC 1 in jeden Brunnen geben und den Deckelinin in den Inkubator bis zur Entfernung der Zona pellucida legen. Nach der Erwärmung und Erholung der D5 menschlichen Embryonen, bewerten Sie sie für die Re-Expansion und fotografieren Sie jeden Embryo.Bewegen Sie jeden Embryo auf 500 Mikroliter eines MOPS gepufferten Handhabungsmediums mit 5%FCS. Behandeln Sie sie dann mit der sauren Tyrodes Lösung, wie sie im Textmanuskript beschrieben ist. Den Embryo mit der sich auflösenden Zona sofort in 300 Mikroliter erwärmtes MOPS-gepuffertes Medium bewegen, um die Tyrodeslösung zu löschen.Dann bewegen Sie den Embryo in eine zentrale Brunnenorgangewebeschale, die das gleichgestellte BM mit 10% SPS unter dem embryokultursen Öl enthält. Dann kehren Sie den Embryo zum 20-Mikroliter-Regenerationstropfen zurück. Bewegen Sie die Embryonen einzeln mit den gleichgezurrten IVC 1-Medien in die Waschschale, und bewegen Sie dann sorgfältig jeden Embryo in einen Brunnen des kammerkammerierten Deckellips, um den Überblick über die Embryo-Identifikation zu behalten.Geben Sie den kammerierten Deckelrutsch für zwei Tage an einen Inkubator zurück, der auf 37 Grad Celsius, 6% Kohlendioxid und Luftsauerstoff eingestellt ist. Am zweiten Tag des Wachstums, untersuchen Sie sorgfältig die Anhaftung der Embryonen unter dem Mikroskop und tauschen Die Medien aus. Wissen Sie, welcher Embryo an der Schale befestigt ist, indem Sie sanft auf die Platte tippen.Um die Medien zu wechseln, entfernen Sie den Deckel und saugen Sie sorgfältig 150 Mikroliter IVC 1 an, wobei Darauf zu achten ist, dass der angeschlossene Embryo nicht gestört wird. Wenn ein Embryo noch nicht an der Platte befestigt ist, tauschen Sie die Medien nicht aus, da das Serum in IVC 1 bei der Befestigung hilft. Langsam Pipette 150 Mikroliter ausgleich verlängerte Kulturmedien, IVC 2 in jeden Brunnen und Ersetzen Sie den Deckel auf dem Deckel.Sorgfältig den kammerierten Deckelschlupf an den Inkubator zurück. Wiederholen Sie den Medienaustausch und die Anhaftungsprüfung jeden Tag, bis die Embryonen zur Fixierung oder zur einzelzelligen Verdauung bereit sind. Wenn die Sammlung der verbrauchten Medien für die weitere Analyse erforderlich ist, fangen Sie die 150 Mikroliter entfernten IVC 1 in ein steriles 0,5 Milliliter-Rohr ein.Waschen Sie jeden Embryo einmal mit 200 Mikroliter PBS, dann fügen Sie 200 Mikroliter Trypsin-Lösung zu jedem Brunnen. Geben Sie den kammerierten Deckelrutsch für fünf Minuten an den Inkubator zurück. Verwenden Sie eine kleine Pipette oder eine fein gezogene Mundpipette, um ein einzelnes MTB aufzunehmen und dann eine größere Pipette zu verwenden, um den Embryo sanft zu dissoziieren, indem Sie nach oben und unten suchen.Den Embryo vorsichtig und wiederholt mit einer Pipettenspitze mit kleinerem Durchmesser weiter anheben, bis der Embryo insgesamt 10 Minuten lang in Trypsin inkubiert wurde. Um eine Einzelzellauswahl durchzuführen, bewegen Sie die dissoziierten Zellen durch 320 Mikroliter Waschtropfen PBS und 0,1%PVP unter Embryokulturöl, wobei darauf geachtet wird, keine Zellen zu verlieren. Nach dem Waschen der Zellen verwenden Sie eine fein gezogene Glaspipette, um eine Zelle auszuwählen.Pipetten Sie die Einzelzelle vorsichtig in ein steriles 0,2 Milliliter Low-Bind-Rohr mit einem minimalen Volumen von PBS und PVP. Schnappen Sie freie Einzelzellen in flüssigem Stickstoff und speichern Sie sie bei negativen 80 Grad Celsius für die weitere Verwendung. Gesunde Embryonen zeigten im Laufe einer ausgedehnten Kultur eine anhaltende Proliferation, während abnorme Embryonen begannen, sich von ihren äußeren Rändern zurückzuziehen und sich aufzulösen.Am achten Tag nach der Befruchtung waren die meisten Zellen in den Embryonen Zytotrophoblasten oder CTBs, die positiv für den Trophoblastenmarker GATA-3 waren. An der Peripherie des Embryos unterschieden sich die CTBs bereits in mehrkernige Synzytiotrophoblasten, die ein blattähnliches Aussehen hatten und positiv für den Menschen CGB gefärbt waren. Am 10. Tag war die Bildung von CGB-positiven wandernden Trophoblastzellen maximal, was durch den Anstieg der HCG-Produktion zu diesem Zeitpunkt bestätigt wurde.Wandernde Trophoblasten, die für HLA-G positiv gefärbt wurden, begannen ebenfalls zu entstehen und aus dem Embryokörper wegzuwandern. Am 12. Tag war die STB-Differenzierung rückläufig und die MTB-Produktion wurde stärker, was auf eine Verlagerung der Schwerpunkte von der Hormonproduktion am 10. Tag auf die Zellmigration am 12. Tag hindeutet. Diese Veränderungen können in einem Zeitraffervideo der Peri-Implantationszeit beobachtet werden.Das Video zeigt den Zusammenbruch des Blastoceles, die Bildung des STB und die eventuelle Differenzierung und Migration von MTB. Das Wichtigste, was Sie bei Abschluss dieses Verfahrens beachten sollten, ist, dass Sie mit lebenden Embryonen arbeiten, die empfindlich auf Temperatur-, Osmolalitäts- und pH-Wert-Änderungen reagieren. Die Minimierung der Zeit, die die Gerichte ageniert aus dem Brutkasten sind, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gesundheit des Embryos.Nach Abschluss dieses Verfahrens können die Forscher isolierte Einzelzellen für nachgeschaltete einzelzellige Omics-Assays wie die sequenziumierende RNA-Sequenzierung einzelner Zellen und die vollständige Genom-Bisulfit-Sequenzierung verwenden, um epigenetische und transkriptomische Veränderungen während der menschlichen Implantation und frühen Plazentabildung besser zu verstehen.

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