Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

ברצוננו להכיר בחולים הרבים במרכז קולורדו לרפואת פוריות (CCRM) שתרמו באדיבות את העוברים שלהם למחקר. ברצוננו גם להודות קארן Maruniak ואת המעבדה הקלינית ב CCRM על עזרתם בעיבוד דגימות hCG, כמו גם סו מקורמיק וצוות אמבריולוגיה הפריה חוץ גופית קלינית שלה ב CCRM על עזרתם עם איסוף עובר, אחסון, מעקב, ותרומה. המימון סופק באופן פנימי על ידי CCRM.

כל העוברים האנושיים נתרמו בהסכמה לשימוש במחקר. פרוטוקולים לתרבות עובר אנושית מורחבת אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית המערבית (מחקר מס' 1179872) ובהתאם להנחיות הבינלאומיות. כל שימוש בעוברים אנושיים חייב להיבחן על ידי האתיקה המתאימה וגופים שלטוניים הקשורים למוסד המחקר באמצעות פרוטוקול זה.
...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

התפתחות הפרוטוקול לתרבות עוברים אנושיים באמצעות השתלה אפשרה למדענים לחקור תקופה לא ממופה בעבר בפיתוח8,9. כאן, אנו משתמשים במערכת תרבות מורחבת כדי לתרבות עוברים אנושיים וללמוד בידול trophoblast מוקדם לפני היווצרות שליה villous. השיטות המתוארות כאן מאפשרות לנו לאסוף ...

השתלה אנושית והוווים של שליה מוקדמת קשה מבחינה היסטורית לחקור ולהישאר ידוע במידה רבה כי רקמות אנושיות אינן נגישות בשלב זה כאשר ההריון הוא בלתי ניתן לגילוי קלינית. מודלים של בעלי חיים אינם מספקים, מכיוון של שליה אנושית יש מאפיינים ייחודיים משלה בהשוואה ליונקים אחרים. לדוגמה, שליה אנושית פולשת עמוק לתוך ההחלטה עם כמה תאים trophoblast להגיע לפחות את השלישי הפנימי של רירית הרחם בעוד תאים אחרים לאשט את העורקים ספירליים הרחם. אפילו אבותינו האבולוציוניים הקרובים ביותר, הפרימטים הלא אנושיים, מראים הבדלים במורפולוגיה שליה ובאינטראקציות טרופיות עם הרקמות המחליטותהאימהיות 1,,2,,3. קבלת עוברים אנושיים לפני ההשתלה במבחנה לא הייתה אפשרית עד בשנות ה-80 כאשר אדם קליני הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) התחיל כתרגול שגרתי לטיפולבפוריות 4. עכשיו, blastocysts אנושי יכול לגדול במבחנה כדי לאפשר את הבחירה של עוברים קיימא יותר להעברה, כמו גם לאפשר בדיקות גנטיות בטוחות. שיפור בטכניקות תרבות העובר, כמו גם את השימוש הגובר של הפריה חוץ גופית הניב blastocysts עודף רבים אשר נשאר לאחר מחזורי הטיפול של המטופל הושלמו. בהסכמת המטופל, אישור IRB, ועם הגבלות מסוימות, blastocysts אלה עשויים להיות מנוצלים למחקרים. הם הפכו למשאב יקר ערך ששימש לגירת תאי גזע עוברייםאנושיים 5, הבנת המעבר של מסת תאים פנימית לתאי גזעעובריים 6,7, ולאחרונה,כבר תרבותית בהצלחה עד היום (ד') 13 כדי לשפץ את ההשתלההאנושית 8,9. על ידי ניצול גישות omics תא יחיד שפותחו לאחרונה, הגישה לשלב השתלה אלה רקמות העובר האנושי הציע הזדמנויות ייחודיות לתאר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את תהליך הבידול תא דינמי מאוד זה, אשר בעבר לא ניתןהיה לחקור 10,11,12,13.
כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפרסום האחרון שלנו המאפיינות את הדינמיקה של בידול trophoblast במהלך השתלהאנושית 12. פרוטוקול זה כולל את ההתחממות של blastocysts זגוגית, תרבות עובר מורחבת עד D12 לאחר הפריה חוץ גופית, עיכול אנזימטי של העובר לתאים בודדים, ואיסוף תאים עבור נתונים במורד הזרם(איור 1). מערכת תרבות מורחבת זו תומכת בשלב פרי-השתלה התפתחות העובר האנושי ללא קלט אימהי וcapitulates בידול trophoblast המופיע בקנה אחד עם תצפיות שנעשו דגימות היסטולוגיות לפנישנים רבות לפני 14,15,16,17. במהלך ההשתלה, אוכלוסיית trophoblast מורכבת לפחות משני סוגי תאים: ציטורופובלסט כמו אב מונוז'יטורופובלסט (CTB) ואת הבדיל הסופני, multinucleated syncytiotrophoblast (STB). עם עיכול trypsin, CTB הם קטנים, תאים עגולים כי הם מורפולוגית לא ניתן להבחין בין נסיונים אחרים של תאים(איור 2A,פאנל שמאלי). הפרדה של CTB מנושאים אחרים של תאים, כגון epiblast ו endoderm פרימיטיבי, ניתן להשיג על ידי פרופילים transcriptomic ברור שלהם גילה על ידי רצף RNA תא יחיד. ניתן לזהות בקלות תאים סנכרוניים כמבנים בעלי צורה לא סדירה, הגדולים משמעותית מסוגי התאים האחרים וממוקמים בעיקר בפריפריה של העובר (איור 2א,לוח אמצעי; איור 2ב', החלונית השמאלית). תאי טרופוביסט נודדים (MTB) הם קו משנה נוסף של trophoblast שנמצא במהלך תרבות מורחבת עובר, ניתן לזהותו כמתרחק לכאורה מן הגוף הראשי של העובר(איור 2A, פאנל ימני, איור 2B,פאנל ימני). trophoblast נודד, למרות הבעת רבים של סמנים זהה כמו trophoblast villous נוסף (EVT), לא צריך להיות מכונה EVT, מאז המבנים villous שליה לא הופיע בשלב מוקדם מאוד זה של פיתוח.
מבחינה ניסיונית, הצלחנו לאסוף CTB קטן STB גדול כי הם ניתן להבחין בקלות לאחר עוברים מתעכלים לתאים בודדים ב D8, D10, ו D12 (איור 2A,B). טרופוביסטים נודדים מתעוררים בשלבים מאוחרים יותר של תרבות העובר המורחבת ותוכל לאסוף אותם ב-D12 לפני עיכול אנזימטי של העובר כולו (איור 2א', ב). על ידי הפרדת שלוש קווי משנה אלה trophoblast לפני ניתוח תא יחיד, אנחנו יכולים לזהות סמנים תעתיק ספציפיים ולהגדיר את התפקיד הביולוגי של כל סוג תא. Cytotrophoblast הם משגשגים מאוד לפעול כתאי אב אדם באספקת תוחסין מובדיל STB ו MTB10,11,12,13. Syncytiotrophoblast מעורבים בייצור הורמוני שליה כדי לשמור על ההריון, עשוי להיות גם אחראי על העוברים חופרים לתוך ריריתהרית הים 10,,11,,12,,13. trophoblast נודד יש תכונות חזקות עוד יותר של פנוטיפ פולשני, נודד והם כנראה אחראים להתיישבות עמוקה ונרחבת יותר של ריריתהרחם הרחם 10,,11,12,,13. לאחר הגדרת החתימה transcriptomic של כל סוג תא, ניתוחי קיבוץ באשכולות חשפו גם שתי קבוצות משנה נוספות של תאים שלא ניתן להבחין מורפולוגית מ CTB והיה transcriptomes עם תכונות של STB ו MTB,בהתאמה 12. תאי שלב ביניים אלה הם כנראה בתהליך של הבדיל CTB או MTB או STB sublineages והיה להתעלם אם עוברים היו מתעכלים באופן עיוור ותאים הופרדו על ידי transcriptome לבד.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במערכת תרבות דו-ממדית (דו-ממדית) ולא יכול להיות אופטימלי לתמיכה בפיתוח מבני תלת מימדי (תלת-ממדי), כפי שהוצע בפרסום שפורסם לאחרונה המתאר מערכת תרבות תלת-ממדית שפותחהלאחרונה 13. אף על פי כן, במערכת דו-מית-מית-מית-ת- נראית כך שההבחנה של טרופהובלסט מוקדמת עולה בקנה אחד עם תצפיות שנעשו בדגימות vivo14,15,16,17. פרוטוקול זה עשוי גם להיות מותאם בקלות לשימוש במערכת תרבות 3D שתוארה לאחרונה13 עם שינויים מינימליים. כל הצעדים מתבצעים עם פיפטה מיקרו-מאניאלית ידנית עם טיפים חד-פעמיים זמינים מסחרית או פיפטת פה מפיפטת זכוכית נשלפת דק המחוברת לצינורות גומי, מסנן ופיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

השתלה אנושית, ההדבקה וההדבקה על אפיתליה פני הרחם והפלישה הבאה של blastocyst לתוך ההחלטה אימהית, הוא אירוע ביולוגי קריטי אך אניגמטי כי היה קשה מבחינה היסטורית ללמוד בשל מגבלות טכניות ואתיות. ההשתלה היא יזם על ידי הפיתוח של trophectoderm כדי trophoblast מוקדם ובדידול הבאים לתוך קווי משנה trophoblast ברורים. בידול trophoblast מוקדם חריג עלול להוביל לכשל השתלה, פתולוגיות שליה, חריגות עובר, הפלה. לאחרונה, פותחו שיטות המאפשרות לעוברים אנושיים לגדול עד היום ה-13 לאחר הפריה במבחנה בהיעדר רקמות אימהיות, פרק זמן המקיף את תקופת ההשתלה בבני אדם. זה נתן לחוקרים את ההזדמנות לחקור השתלה אנושית ולסיכום הדינמיקה של בידול trophoblast בתקופה קריטית זו מבלי לבלבל השפעות אימהיות והימנעות מכשולים טבועים ללמוד אירועי בידול העובר מוקדם ב vivo. כדי לאפיין תת-קוובלסטים שונים במהלך ההשתלה, אימצנו שיטות תרבות דו-ממדיות (דו-ממדיות) קיימות ופיתחו הליך לעיכול אנזימטי ולבודד סוגים שונים של תאי טרופוביסט לתאגידות במורד הזרם. עוברים תרבותיים בתנאים דו-ממדיים יש מורפולוגיה שטוחה יחסית עשוי להיות תת אופטימלי במידול בארכיטקטורות עובריות vivo תלת מימדי (3D). עם זאת, בידול trophoblast נראה פחות מושפע כפי שהוכח על ידי מורפולוגיה צפויה ושינויים ביטוי גנים במהלך תרבות מורחבת. קווי משנה שונים של trophoblast, כולל ציטוטרוהובלסט, סינכרון ו-trophoblast נודדים יכולים להיות מופרדים לפי גודל, מיקום והופעה זמנית, ולהשתמש בהם לאפיון נוסף או ניסויים. חקירה של תאים אלה trophoblast מוקדם עשוי להיות חיוני בהבנת השתלה אנושית, טיפול פתולוגיות שליה נפוצות, ולהקל על השכיחות של אובדן הריון.

עוברים בריאים הפגינו המשך התפשטות במהלך תרבות מורחבת (איור 2B). עוברים חריגים החלו לסגת מהקצוות החיצוניים שלהם והתפוררו(איור 2C). מניסיוני, כ-75% מהעוברים היו מחוברים לתחתית המנה המצופה בפיברונקטין ב-48 שעות והחיבור גדל לכ-90% ב-72 שעות בתרבות. ההצלחה של חיבור העוב?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

הריונות רבים נכשלים בשלב מוקדם בהתפתחות העובר האנושי סביב שבע או שמונה לאחר ההפריה. פרוטוקול זה מציע הזדמנויות לחוקרים לגדל מושגים אנושיים במבחנה במהלך חלון ההשתלה המסתורי הזה. זה מאפשר לנו להבין את המנגנונים העומדים ביסוד ההצלחה של השתלה אנושית היווצרות שליה מוקדמת.שימוש במערכת תרבות מורחבת לגידול עוברים אנושיים בשלב פרי-השתלה במבחנה הוא כנראה הדרך היחידה להשיג חומרים אותנטיים לחקר השתלה והתמדה מוקדמת של טרופובלסט. טכניקה פשוטה זו היא כלי רב עוצמה המאפשר לנו לענות על שאלות בסיסיות רבות על ההתפתחות המוקדמת האנושית. מחקר שנערך עם השימוש בפרוטוקול זה יתרום במידה רבה להבנת אובדן הריון מוקדם, כשל בהשתלה חוזרת ונשנית ופתולוגיות שליה.הפגנת ההליך תהיה דירדרה לוגסון, סטודנטית לדוקטורט ממעבדה. יום אחד לפני התחממות העובר, הכינו את לוחות התקשורת וההתאוששות במכסה המנוע של זרימה למינארית סטרילית. מלאו שתי מנות שטיפת תרבות איברים מרכזיות היטב ב-500 מיקרוליטרים של BM עם 10%SPS, ולאחר מכן כסו את ה-BM ב-500 מיקרוליטרים של שמן ברמת תרבות העוברים.בצלחת תרבות רקמה 16 מילימטר, שכבה שמונה מיליליטר של שמן תרבות העובר עוגן 20 טיפות microliter של BM עם 10% SPS לתחתית. לצייד את כלים לשטוף צלחת התאוששות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 6% פחמן דו חמצני ו 5% חמצן לפחות ארבע שעות. Aliquot כארבעה מיליליטר של IVC 1 לתוך צינור כובע הצמד חמישה מיליליטר ולהכין צלחת כביסה אחת עם 500 microliters של IVC 1 ללא כיסוי שמן.יש לצייד את המנה והצינור באינקובטור למשך ארבע שעות לפחות. לדלל פיברונאטין מנסיוב אנושי ב PBS ל 30 מיקרוגרם למיליליטר. פתח את שמונה חבילת כיסויים תאים היטב דואג לא לגעת בארות, ואז בעדינות pipette 250 microliters של fibronectin לתוך כל באר.החלף את המכסה על כיסוי הדגירה אותו בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 עד 24 שעות. הכינו את צלחת התרבות המורחבת בבוקר של התחממות העוברים. אחזר את החלקת הכיסוי התאית עם פיברונקין והצב אותה במכסה המנוע של הזרימה למינארית.לאחר מכן להסיר את תערובת fibronectin עם פיפטה מיליליטר אחד להשליך אותו. פיפטה 300 microliters של IVC שיווי משקל 1 לתוך כל באר ולמקום את הכיסוי לתוך החממה עד הסרת שונה pellucida. לאחר התחממות והתאוששות של העוברים האנושיים D5, להעריך אותם להתרחבות מחדש ולצלם של כל עובר.העבר כל עובר ל- 500 מיקרוליטרים של אמצעי טיפול במאגר MOPS עם 5%FCS. ואז לטפל בו עם הפתרון של טיירוד חומצי כמתואר בכתב היד טקסט. מיד להזיז את העובר עם zona מתמוסס לתוך 300 microliters של מדיום חנית MOPS מחומם כדי להרווה את הפתרון של טירודה.ואז להעביר את העובר לתוך צלחת רקמת איברים באר מרכזית המכילה את BM משובץ עם 10% SPS תחת שמן כיתה תרבות העובר. ואז להחזיר את העובר לירידה 20 התאוששות microliter. בנפרד להעביר את העוברים לצלחת לשטוף עם המדיה IVC 1 שיווי משקל, ואז בזהירות להעביר כל עובר ל הבאר של כיסוי התא, הקפדה לעקוב אחר זיהוי העובר.החזירו את הכיסויים הקאמריים לאנקובטור שנקבע ל-37 מעלות צלזיוס, 6% פחמן דו-חמצני וחמצן אטמוספרי למשך יומיים. ביום השני, בחנו היטב את ההחזקה של העוברים מתחת למיקרוסקופ והחליפו את התקשורת. לדעת איזה עובר מחובר לצלחת על ידי הקשה עדין על הצלחת.כדי לשנות את התקשורת, להסיר את המכסה בזהירות שאפו 150 microliters של IVC 1, דואג לא להפריע העובר המצורף. אם העובר עדיין לא מחובר לצלחת, אל תחליף את התקשורת מכיוון שהנסיוב ב- IVC 1 יסייע בהחזקה. לאט לאט pipette 150 microliters של מדיה תרבותית מורחבת שווה, IVC 2 לתוך כל באר ולהחליף את המכסה על כיסוי.החזיר בזהירות את הכיסויים הקאמריים לאנקובטור. חזור על חילופי מדיה ובדיקה מצורפת כל יום עד העוברים מוכנים קיבעון או עיכול תא יחיד. אם אוסף של מדיה בילה הכרחי לניתוח נוסף, הצמד להקפיא את 150 microliters של IVC הוסר 1 לתוך צינור סטרילי נמוך לאגד 0.5 מיליליטר.לשטוף כל עובר פעם אחת עם 200 microliters של PBS, ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של פתרון טריפסין לכל באר. החזירו את הכיסויים הקאמריים לאנקובטור לחמש דקות. השתמש פיפטה קטנה או פיפטה בפה משוך דק להרים MTB בודדים ואז להשתמש פיפטה גדולה יותר בעדינות לנתק את העובר על ידי שאיפה למעלה ולמטה.המשך לשאוב את העובר בעדינות ושוב ושוב באמצעות קצה פיפטה בקוטר קטן יותר עד שהעובר הודגר במשך סך של 10 דקות ב טריפסין. כדי לבצע בחירת תא יחיד, להעביר את התאים דיסוציאציה דרך 320 טיפות לשטוף microliter של PBS ו 0.1% PVP תחת שמן תרבות העובר, דואג לא לאבד תאים. לאחר שטיפת התאים להשתמש פיפטה זכוכית משוך דק כדי לבחור תא אחד.בזהירות pipette התא הבודד לתוך צינור קשירה נמוך סטרילי 0.2 מיליליטר עם נפח מינימלי של PBS ו PVP. הצמד תאים בודדים חינם בחנקן נוזלי ולאחסן אותם ב 80 מעלות צלזיוס שלילי לשימוש נוסף. עוברים בריאים הפגינו התפשטות מתמשכת במהלך התרבות המורחבת, בעוד עוברים חריגים החלו לסגת מהקצוות החיצוניים שלהם להתפורר.ביום שמונה לאחר ההפריה, רוב התאים בעוברים היו ציטוטרופיבלסט או CTBs, שהיו חיוביים עבור סמן trophoblast GATA-3. בפריפריה של העובר, CTBs כבר התבהר לתוך סינקטיוטרופיבלסטים מרובי גרעינים, אשר היה גיליון כמו המראה מוכתם חיובי עבור בני אדם CGB. ביום 10, היווצרותם של תאי טרופובלסט נודדים חיוביים של CGB הייתה מקסימלית, אשר אושרה על ידי העלייה בייצור HCG בשלב זה.טרופובלסטים נודדים שהכתימו חיובי עבור HLA-G, החלו גם הם לצאת ולהגר הרחק מגוף העובר. ביום 12, התמדת STB הייתה בירידה וייצור MTB הפך בולט יותר, מה שמרמז על שינוי של דגש מייצור הורמון ביום 10 להגירה סלולרית ביום 12. שינויים אלה ניתן לראות וידאו לשגות זמן של תקופת ההשתלה פרי.הסרטון מדגים את קריסתו של blastocele, היווצרות STB, ואת ההתברמות וההגירה בסופו של דבר של MTB. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת השלמת הליך זה הוא שאתה עובד עם עוברים חיים רגישים לשינויים בטמפרטורה, osmolality ו- pH. צמצום משך הזמן שהמנות יוצאות מהאינקובטור הוא קריטי לשמירה על בריאות העובר.לאחר השלמת הליך זה, החוקרים יכולים להשתמש בתאים בודדים מבודדים עבור בדיקות omics תא יחיד במורד הזרם, כגון רצף RNA תא יחיד רצף דו-קוטבי הגנום כולו כדי להבין טוב יותר שינויים אפיגנטיים ותעתיקים במהלך ההשתלה האנושית היווצרות השליה המוקדמת.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

תא יחיד transfection בעוברים צ&#39;יק

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...