Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

हम प्रजनन चिकित्सा के लिए कोलोराडो केंद्र (CCRM) है कि शालीनता से अनुसंधान के लिए अपने भ्रूण दान किया है पर कई रोगियों को स्वीकार करना चाहते हैं । हम एचसीजी नमूनों के प्रसंस्करण में उनकी मदद के लिए करेन मारुनियाक और सीसीआरएम में नैदानिक प्रयोगशाला के साथ-साथ मुकदमा मैककॉर्मिक और सीसीआरएम में उसके नैदानिक आईवीएफ भ्रूणविज्ञान टीम को भ्रूण संग्रह, भंडारण, ट्रैकिंग और दान के साथ उनकी मदद के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं। सीसीआरएम द्वारा आंतरिक रूप से वित्तपोषण प्रदान किया गया था ।

सभी मानव भ्रूण अनुसंधान में उपयोग के लिए सहमति के साथ दान किया गया है । विस्तारित मानव भ्रूण संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल पश्चिमी संस्थागत समीक्षा बोर्ड (अध्ययन संख्या ११७९८७२) द्वारा अनुमोदित किया गया ?...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

प्रत्यारोपण के माध्यम से मानव भ्रूण को संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल के विकास ने वैज्ञानिकों को विकासमेंपहले से अज्ञात समय का पता लगाने की अनुमति दी है8 ,9. यहां, हम मानव भ्रूण संस्कृत?...

मानव प्रत्यारोपण और प्रारंभिक अपरा के उद्भव ऐतिहासिक रूप से जांच करने के लिए मुश्किल है और काफी हद तक अज्ञात रहते हैं क्योंकि मानव ऊतक इस स्तर पर दुर्गम हैं जब गर्भावस्था चिकित्सकीय अज्ञेय है। पशु मॉडल अपर्याप्त हैं, क्योंकि मानव अपरा में अन्य यूथेरियन स्तनधारियों की तुलना में अपनी अनूठी विशेषताएं हैं। उदाहरण के लिए, मानव प्लेसेंटा कुछ ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं के साथ गर्भाशय मायोमेट्रियम के भीतरी तीसरे तक पहुंचने के साथ डिसिडुआ में गहराई से हमला करता है जबकि अन्य कोशिकाएं गर्भाशय सर्पिल धमनियों को फिर से तैयार करती हैं। यहां तक कि हमारे निकटतम विकासवादी पूर्वजों, गैर-मानव वानरों, मातृ,डिकिडुअल ऊतकों1,2,3के साथ अपरा आकृति विज्ञान और ट्रोफोब्लास्ट बातचीत में अंतर दिखाते हैं।, प्री-इम्प्लांटेशन मानव भ्रूण इन विट्रो प्राप्त करना 1 9 80 के दशक तक संभव नहीं था जब नैदानिक मानव इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) बांझपन4के इलाज के लिए एक नियमित अभ्यास के रूप में शुरू हुआ था। अब, मानव ब्लास्टोसिस्ट को विट्रो में उगाया जा सकता है ताकि हस्तांतरण के लिए अधिक व्यवहार्य भ्रूण के चयन के लिए अनुमति दी जा सके, साथ ही सुरक्षित आनुवंशिक परीक्षण को सक्षम किया जा सके । भ्रूण संस्कृति तकनीकों में सुधार के साथ-साथ आईवीएफ के बढ़ते उपयोग से कई अधिशेष ब्लास्टोसिस्ट मिले हैं जो रोगी के उपचार चक्र पूरा होने के बाद रहता है । रोगी की सहमति, आईआरबी अनुमोदन के साथ, और कुछ प्रतिबंधों के साथ, इन ब्लास्टोसिस्ट का उपयोग अनुसंधान अध्ययनों के लिए किया जा सकता है। वे एक अमूल्य संसाधन बन गए हैं जिनका उपयोग मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के व्युत्पन्न के लिए किया गया था5,भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के संक्रमण को समझना6,7और हाल ही में, मानव प्रत्यारोपण8, 9,9को फिर से तैयार करने के लिए दिन (डी) 13 तक सफलतापूर्वक सुसंस्कृत किया गया है।, हाल ही में विकसित एकल कोशिका ओमिक्स दृष्टिकोणों का उपयोग करके, इन प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण ऊतकों तक पहुंच ने आणविक तंत्र का वर्णन करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान किए हैं जो इस अत्यधिक गतिशील कोशिका भेदभाव प्रक्रिया को विनियमित करते हैं, जो पहले10, 11,,12,,,13का पता लगाने के लिए असंभव थे।12
यहां, हम मानव प्रत्यारोपण12के दौरान ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव की गतिशीलता की विशेषता हमारे हाल के प्रकाशन में इस्तेमाल किए गए तरीकों का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में विट्रीफाइड ब्लास्टोसिस्ट का वार्मिंग, डी12 पोस्ट आईवीएफ तक विस्तारित भ्रूण संस्कृति, भ्रूण को एकल कोशिकाओं में एंजाइमेटिक पाचन, और डाउनस्ट्रीम परख(चित्रा 1)के लिए सेल संग्रह शामिल है। यह विस्तारित संस्कृति प्रणाली मातृ इनपुट के बिना पेरी-प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण विकास का समर्थन करती है और ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव को पुनः प्राप्त करती है जो कई साल पहले 14 ,15,, 16,17 ,,17को हिस्टोलॉजिकल नमूनों से की गई टिप्पणियोंकेअनुरूप दिखाई देती है।17 प्रत्यारोपण के दौरान, ट्रोफोब्लास्ट आबादी में कम से कम दो सेल प्रकार शामिल होते हैं: मोनोन्यूक्लिटेड प्रोजेनिटर जैसे साइटोट्रोफोब्लास्ट (सीटीबी) और मरणासन्न विभेदित, बहुआयामी सिंक्टियोट्रोफोब्लास्ट (एसटीबी)। ट्रिप्सिन पाचन पर, सीटीबी छोटी, गोल कोशिकाएं हैं जो अन्य सेल वंश(चित्रा 2 ए, बाएंपैनल) से रूपात्मक रूप से अविवेच्य हैं। एपिब्लास्ट और आदिम एंडोडर्म जैसे अन्य सेल वंशों से सीटीबी का पृथक्करण, एकल सेल आरएनए अनुक्रमण द्वारा प्रकट उनके अलग-अलग ट्रांसक्रिप्टोर्मिक प्रोफाइल द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। सिंक्टियोट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं को आसानी से अनियमित आकार की संरचनाओं के रूप में पहचाना जा सकता है जो अन्य सेल प्रकारों की तुलना में काफी बड़े होते हैं और मुख्य रूप से भ्रूण की परिधि में स्थित होते हैं(चित्रा 2 ए,मध्य पैनल; चित्रा 2B,बाएं पैनल) । प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाएं (एमटीबी) भ्रूण विस्तारित संस्कृति के दौरान पाई जाने वाली एक और ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज हैं और इसे भ्रूण के मुख्य शरीर(चित्रा 2 ए,राइट पैनल, फिगर 2 बी,राइट पैनल) से दूर जाने के रूप में पहचाना जा सकता है। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट, हालांकि अतिरिक्त ट्रोफोब्लास्ट (ईवीटी) के रूप में एक ही मार्कर के कई व्यक्त करते हुए, ईवीटी के रूप में संदर्भित नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि अपरा में लहंगा संरचनाएं विकास के इस प्रारंभिक चरण में नहीं उभरी हैं।
प्रायोगिक रूप से, हम छोटे सीटीबी और बड़े एसटीबी को इकट्ठा करने में सक्षम थे जो भ्रूण को डी 8, डी 10 और डी 12(चित्रा 2ए, बी)में एकल कोशिकाओं में पचाने के बाद आसानी से अलग होते हैं। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट विस्तारित भ्रूण संस्कृति के बाद के चरणों में उत्पन्न होते हैं और पूरे भ्रूण(चित्रा 2ए, बी)के एंजाइमेटिक पाचन से पहले D12 में एकत्र किए जा सकते हैं। एकल कोशिका विश्लेषण से पहले इन तीन ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज को अलग करके, हम विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोमिक मार्कर की पहचान कर सकते हैं और प्रत्येक कोशिका प्रकार की जैविक भूमिका को परिभाषित कर सकते हैं। साइटोट्रोफोब्लास्ट अत्यधिक प्रसारात्मक होते हैं और एसटीबी और एमटीबी विभेदित वंश 10 , 11,12,,1313की आपूर्ति में जनक कोशिकाओं के रूप में कार्य करते हैं ।10 सिंकियटोट्रोफोब्लास्ट गर्भावस्था को बनाए रखने के लिए अपरा हार्मोन का उत्पादन करने में शामिल हैं और एंडोमेट्रियम10 , 11 , 12,,13में बिल करने वालेभ्रूणोंके लिए भी जिम्मेदार होसकते13हैं। प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट में आक्रामक, प्रवासी फेनोटाइप की और भी मजबूत विशेषताएं हैं और गर्भाशय एंडोमेट्रियम10 , 11,,,12,13के गहरे और अधिक व्यापक उपनिवेशीकरणकेलिए जिम्मेदार हैं। प्रत्येक कोशिका प्रकार के प्रतिलिपि हस्ताक्षर को परिभाषित करने के बाद, क्लस्टरिंग विश्लेषणों से कोशिकाओं के दो अतिरिक्त सबसेट का भी पता चला है जो सीटीबी से रूपात्मक रूप से अविवेच्य थे और क्रमशः12एसटीबी और एमटीबी की विशेषताओं के साथ ट्रांसक्रिप्टोम थे । इन मध्यवर्ती चरण कोशिकाओं सीटीबी से या तो एमटीबी या एसटीबी सबलाइनेज में अंतर की प्रक्रिया में होने की संभावना है और अगर भ्रूण आंख बंद करके पचा रहे थे और कोशिकाओं को अकेले ट्रांसक्रिप्टोम द्वारा अलग किया गया था अनदेखी की गई होगी ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक दो आयामी (2डी) संस्कृति प्रणाली का उपयोग करता है और त्रि-आयामी (3 डी) संरचनात्मक विकास का समर्थन करने के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है, जैसा कि हाल ही में एक नव विकसित 3 डी संस्कृति प्रणाली13का वर्णन करते हुए एक प्रकाशन द्वारा सुझाया गया है । फिर भी , इस 2डी प्रणाली में प्रारंभिक ट्रोफोब्लास्ट का अंतर वीवो नमूनों14 , 15, 16,,,1717में से की गई टिप्पणियोंकेअनुरूप प्रतीत होता है । इस प्रोटोकॉल को न्यूनतम परिवर्तनों के साथ हाल ही में वर्णित 3 डी संस्कृति प्रणाली13 में उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। सभी कदम एक हाथ में माइक्रोमैनिमुलेशन पिपेट के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डिस्पोजेबल टिप्स या रबर ट्यूबिंग, एक फिल्टर और एक मुखपत्र से जुड़े पतले खींचे गए ग्लास पिपेट से मुंह पिपेट के साथ किए जाते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

मानव प्रत्यारोपण, अपोजिशन और गर्भाशय की सतह एपिथेलिया के लिए आसंजन और मातृ decidua में ब्लास्टोसिस्ट के बाद आक्रमण, एक महत्वपूर्ण अभी तक रहस्यपूर्ण जैविक घटना है कि ऐतिहासिक रूप से तकनीकी और नैतिक सीमाओं के कारण अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है । प्रत्यारोपण ट्रोफेक्टोडर्म के विकास से शुरुआत की जाती है ताकि जल्दी ट्रोफोब्लास्ट और बाद में अलग-अलग ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनीज में भेदभाव हो। एबररेंट अर्ली ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव से प्रत्यारोपण विफलता, अपरा विकृतियों, भ्रूण असामान्यताओं और गर्भपात हो सकते हैं। हाल ही में, मानव भ्रूण को मातृ ऊतकों की अनुपस्थिति में विट्रो में 13 के बाद निषेचन तक बढ़ने की अनुमति देने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं, एक समय-अवधि जिसमें मनुष्यों में प्रत्यारोपण अवधि शामिल है। इससे शोधकर्ताओं को मानव प्रत्यारोपण की जांच करने और मातृ प्रभावों को भ्रमित किए बिना इस महत्वपूर्ण अवधि के दौरान ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव की गतिशीलता को पुनः रीकैपिटल करने और वीवो में प्रारंभिक भ्रूण भेदभाव की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अंतर्निहित बाधाओं से बचने का अवसर मिला है । प्रत्यारोपण के दौरान विभिन्न ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज की विशेषता के लिए, हमने मौजूदा दो-आयामी (2D) विस्तारित संस्कृति विधियों को अपनाया है और डाउनस्ट्रीम परख के लिए विभिन्न प्रकार की ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से पचाने और अलग करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की है। 2डी स्थितियों में सुसंस्कृत भ्रूण में अपेक्षाकृत चपटा आकृति विज्ञान होता है और वीवो त्रि-आयामी (3 डी) भ्रूणीय आर्किटेक्चर में मॉडलिंग में उप-अनुकूल हो सकता है। हालांकि, ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव कम प्रभावित होने लगता है जैसा कि विस्तारित संस्कृति के दौरान प्रत्याशित आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। साइटोट्रोफोब्लास्ट, सिंकियोट्रोफोब्लास्ट और प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट सहित विभिन्न ट्रोफोब्लास्ट सबलाइनेज को आकार, स्थान और लौकिक उद्भव से अलग किया जा सकता है, और आगे लक्षण वर्णन या प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है। इन प्रारंभिक ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं की जांच मानव प्रत्यारोपण को समझने, आम अपरा विकृतियों का इलाज करने और गर्भावस्था के नुकसान की घटनाओं को कम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई जा सकती है।

स्वस्थ भ्रूण विस्तारित संस्कृति(चित्रा 2B)के पाठ्यक्रम पर निरंतर प्रसार का प्रदर्शन किया । असामान्य भ्रूण अपने बाहरी किनारों से वापस लेना और विखंडित(चित्रा 2C)करने लगे। हमारे अनु...

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Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

यहां, हम विट्रीफाइड ह्यूमन ब्लास्टोसिस्ट को गर्म करने, उन्हें विट्रो में प्रत्यारोपण अवधि के माध्यम से बनाने, उन्हें एकल कोशिकाओं में पचाने और आगे की जांच के लिए जल्दी ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

पेरी-प्रत्यारोपण चरण मानव भ्रूण में ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं का एकल सेल संग्रह

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

कई गर्भधारण सात या आठ के बाद निषेचन के आसपास मानव भ्रूण के विकास में जल्दी विफल । यह प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को इस रहस्यमय प्रत्यारोपण खिड़की के दौरान विट्रो में मानव अवधारणाओं को विकसित करने के अवसर प्रदान करता है। यह हमें उन तंत्रों को समझने की अनुमति देता है जो मानव प्रत्यारोपण और प्रारंभिक अपरा गठन की सफलता को रेखांकित करते हैं।एक विस्तारित संस्कृति प्रणाली का उपयोग करने के लिए पेरी प्रत्यारोपण चरण विट्रो में मानव भ्रूण विकसित शायद एक ही तरीका है प्रत्यारोपण और जल्दी trophoblast भेदभाव का अध्ययन करने के लिए प्रामाणिक सामग्री प्राप्त है । यह सीधी तकनीक एक शक्तिशाली उपकरण है जो हमें मानव प्रारंभिक विकास के बारे में कई बुनियादी सवालों के जवाब देने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ किए गए शोध काफी हद तक प्रारंभिक गर्भावस्था हानि, आवर्ती प्रत्यारोपण विफलता और अपरा विकृतियों की समझ में योगदान देंगे।प्रक्रिया का प्रदर्शन Deirdre Logsdon, एक प्रयोगशाला से पीएचडी के छात्र होगा । भ्रूण वार्मिंग से एक दिन पहले, एक बाँझ लेमिनार प्रवाह हुड में मीडिया और वसूली प्लेटें तैयार करें। 10% एसपीएस के साथ बीएम के 500 माइक्रोलीटर के साथ दो केंद्र अच्छी तरह से अंग संस्कृति धोने के व्यंजन भरें, फिर भ्रूण संस्कृति ग्रेड तेल के 500 माइक्रोलीटर के साथ बीएम को कवर करें।एक 16 मिलीमीटर ऊतक संस्कृति पकवान में, परत भ्रूण संस्कृति तेल और लंगर के आठ मिलीलीटर बीएम के 20 माइक्रोलीटर बूंदें 10% एसपीएस के साथ नीचे करने के लिए । कम से चार घंटे के लिए एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 6% कार्बन डाइऑक्साइड और 5% ऑक्सीजन में धोने के बर्तन और वसूली प्लेट को बराबर करें। अलीकोट एक पांच मिलीलीटर स्नैप कैप ट्यूब में IVC 1 के लगभग चार मिलीलीटर और कोई तेल ओवरले के साथ आईवीसी 1 के ५०० माइक्रोलीटर के साथ एक धोने पकवान तैयार करते हैं ।इनक्यूबेटर में डिश और ट्यूब को कम से कम चार घंटे तक समतुलित करें। पीबीएस में मानव सीरम से 30 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर को पतला फाइब्रोनेक्टिन। कुओं को छूने के लिए ध्यान नहीं रखते हुए आठ अच्छी तरह से कक्षित कवरस्लिप पैकेज खोलें, फिर धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में फाइब्रोनेक्टिन के 250 माइक्रोलीटर पिपेट करें।कवरलिप पर ढक्कन को बदलें और इसे 20 से 24 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। भ्रूण वार्मिंग की सुबह विस्तारित संस्कृति प्लेट तैयार करें। फाइब्रोनेक्टिन के साथ कक्ष कवर स्लिप को पुनः प्राप्त करें और इसे लैमिनार प्रवाह हुड में रखें।इसके बाद फाइब्रोनेक्टिन मिश्रण को एक मिलीलीटर पिपेट से निकाल कर फेंक दें। प्रत्येक कुएं में समतुल्य आईवीसी 1 के पिपेट 300 माइक्रोलीटर और जोना पेलुसिडा को हटाने तक कवरस्लिप को इनक्यूबेटर में रखें। वार्मिंग और D5 मानव भ्रूण की वसूली के बाद, उन्हें फिर से विस्तार के लिए आकलन और प्रत्येक भ्रूण की तस्वीरें ले लो।प्रत्येक भ्रूण को 5% एफसीएस के साथ एमओपी बफर हैंडलिंग माध्यम के 500 माइक्रोलीटर में ले जाएं। फिर इसे अम्ल टायरोड के समाधान के साथ इलाज करें जैसा कि पाठ पांडुलिपि में वर्णित है। तुरंत टायरोड के समाधान को बुझाने के लिए गर्म एमओपी के 300 माइक्रोलीटर में भंग जोना के साथ भ्रूण को स्थानांतरित करें।फिर भ्रूण संस्कृति ग्रेड तेल के तहत 10% एसपीएस के साथ समतुल्य बीएम युक्त एक केंद्रीय अच्छी तरह से अंग ऊतक पकवान में भ्रूण को स्थानांतरित करें। फिर भ्रूण को 20 माइक्रोलीटर रिकवरी ड्रॉप में वापस करें। व्यक्तिगत रूप से समतुल्य IVC 1 मीडिया के साथ धोने पकवान के लिए भ्रूण ले जाएँ, तो ध्यान से कक्षित कवरस्लिप की एक अच्छी तरह से प्रत्येक भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए, भ्रूण की पहचान का ट्रैक रखने के लिए सुनिश्चित कर रही है।दो दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 6% कार्बन डाइऑक्साइड और वायुमंडलीय ऑक्सीजन के लिए सेट एक इनक्यूबेटर के लिए कक्ष कवरलिप वापस करें। दो दिन में, ध्यान से माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण के लगाव की जांच और मीडिया का आदान प्रदान । जानिए धीरे-धीरे प्लेट को टैप करके डिश से कौन सा भ्रूण जुड़ा होता है।मीडिया को बदलने के लिए, ढक्कन हटा दें और ध्यान से IVC 1 के १५० माइक्रोलीटर आकांक्षी, ध्यान रखने के लिए संलग्न भ्रूण परेशान नहीं है । यदि कोई भ्रूण अभी तक प्लेट से जुड़ा नहीं है, तो मीडिया का आदान-प्रदान न करें क्योंकि आईवीसी 1 में सीरम लगाव में सहायता करेगा । धीरे-धीरे 150 माइक्रोलीटर समतुल्य विस्तारित संस्कृति मीडिया, आईवीसी 2 प्रत्येक अच्छी तरह से और कवरस्लिप पर ढक्कन को बदलें।ध्यान से इनक्यूबेटर को कक्ष कवरलिप वापस कर दिया। जब तक भ्रूण निर्धारण या एकल कोशिकीय पाचन के लिए तैयार न हो जाए तब तक हर दिन मीडिया एक्सचेंज और अटैचमेंट चेक दोहराएं। यदि खर्च किए गए मीडिया का संग्रह आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक है, तो स्नैप हटाए गए आईवीसी 1 के 150 माइक्रोलीटर को बाँझ कम बांध 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में फ्रीज करें।प्रत्येक भ्रूण को पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर के साथ एक बार धोएं, फिर प्रत्येक कुएं में ट्राइप्सिन समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। चैंबर कवर्लिप को इनक्यूबेटर में पांच मिनट के लिए लौटाएं। एक व्यक्ति एमटीबी लेने के लिए एक छोटे से पिपेट या पतले खींचे गए मुंह पिपेट का उपयोग करें, फिर ऊपर और नीचे उठकर भ्रूण को धीरे-धीरे अलग करने के लिए एक बड़े पिपेट का उपयोग करें।भ्रूण धीरे और बार-बार एक छोटे व्यास पिपेट टिप का उपयोग करते हुए तब तक जारी रखें जब तक कि भ्रूण को ट्राइप्सिन में कुल 10 मिनट तक इनक्यूबेटेड न किया जाए। एकल कोशिका चयन करने के लिए, पीबीएस के 320 माइक्रोलीटर वॉश ड्रॉप और भ्रूण संस्कृति तेल के तहत 0.1% पीवीपी के माध्यम से अलग कोशिकाओं को स्थानांतरित करें, किसी भी कोशिकाओं को खोने का ख्याल न रखें। कोशिकाओं को धोने के बाद एक सेल का चयन करने के लिए एक पतले खींचे गए ग्लास पिपेट का उपयोग करें।ध्यान से पीबीएस और पीवीपी की न्यूनतम मात्रा के साथ एक बाँझ 0.2 मिलीलीटर कम बांध ट्यूब में एकल कोशिका को पिपेट करें। तरल नाइट्रोजन में मुक्त एकल कोशिकाओं स्नैप और आगे के उपयोग के लिए नकारात्मक ८० डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर । स्वस्थ भ्रूण विस्तारित संस्कृति के पाठ्यक्रम पर निरंतर प्रसार का प्रदर्शन किया, जबकि असामान्य भ्रूण अपने बाहरी किनारों से वापस लेना और विघटित करने के लिए शुरू किया ।दिन आठ पोस्ट निषेचन में, भ्रूण में अधिकांश कोशिकाएं साइटोट्रोफोब्लास्ट या सीटीबी थीं, जो ट्रोफोब्लास्ट मार्कर गैटा-3 के लिए सकारात्मक थीं। भ्रूण की परिधि पर, CTBs पहले से ही बहु-नाभिक सिंकियोट्रोफोब्लास्ट में अंतर कर रहे थे, जिसमें उपस्थिति जैसी शीट थी और मनुष्यों के लिए सीजीबी के लिए सकारात्मक दाग था । 10 दिन में सीजीबी पॉजिटिव प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट सेल्स का गठन अधिकतम रहा, जिसकी पुष्टि इस समय एचसीजी उत्पादन में उछाल से हुई।एचएलए-जी के लिए सकारात्मक दाग वाले प्रवासी ट्रोफोब्लास्ट भी उभरने लगे और भ्रूण के शरीर से दूर चले गए । 12 दिन तक, एसटीबी भेदभाव में गिरावट आई और एमटीबी उत्पादन अधिक प्रमुख हो गया, 10 दिन पर हार्मोन उत्पादन से 12 दिन में सेल माइग्रेशन पर जोर देने का सुझाव दिया गया । ये परिवर्तन पेरी-प्रत्यारोपण अवधि के एक समय चूक वीडियो में देखा जा सकता है।वीडियो ब्लास्टोसेल के पतन, एसटीबी के गठन, और अंततः भेदभाव और एमटीबी के प्रवास को दर्शाता है । इस प्रक्रिया को पूरा करते समय ध्यान में रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि आप जीवित भ्रूण के साथ काम कर रहे हैं जो तापमान, ओस्मोलिटी और पीएच में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं। समय की मात्रा को कम करना है कि व्यंजन इनक्यूबेटर से बाहर हैं भ्रूण के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।इस प्रक्रिया को पूरा करने के बाद, जांचकर्ता मानव प्रत्यारोपण और प्रारंभिक अपरा गठन के दौरान एपिजेनेटिक और ट्रांसक्रिप्टोर्मिक परिवर्तनों को बेहतर ढंग से समझने के लिए एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण और पूरे जीनोम बिसुल्फिट अनुक्रमण जैसे डाउनस्ट्रीम सिंगल सेल ओमिक्स के लिए अलग एकल कोशिकाओं का उपयोग कर सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Midgastrula स्टेज ड्रोसोफिला भ्रूण से Neuronal संस्कृति की तैयारी

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

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In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

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Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

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Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

चिकी भ्रूण में एकल सेल अभिकर्मक

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

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जहाँ रहते इमेजिंग सेल आकार बदलें ड्रोसोफिला भ्रूण

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

ऊतक विशिष्ट प्रारंभिक चरण माउस भ्रूण का उपयोग जीन के लिए chromatin immunoprecipitation परख

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Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

प्राथमिक माउस ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं और ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण परख के अलगाव

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) GFP साथ रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग में दैहिक कोशिकाओं reprogramming

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

सेंडाइ वायरस के साथ मानव दैहिक कोशिकाओं से कुशल उत्पादन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...