Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Vorremmo riconoscere i molti pazienti del Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) che hanno gentilmente donato i loro embrioni per la ricerca. Vorremmo anche ringraziare Karen Maruniak e il laboratorio clinico di CCRM per il loro aiuto nell'elaborazione di campioni di hCG, così come Sue McCormick e il suo team clinico di embriologia in fecondazione in vitro presso CCRM per il loro aiuto nella raccolta, stoccaggio, monitoraggio e donazione degli embrioni. Il finanziamento è stato fornito internamente da CCRM.

Tutti gli embrioni umani sono stati donati con il consenso per l'uso nella ricerca. I protocolli per la coltura estesa degli embrioni umani sono stati approvati dal Western Institutional Review Board (studio n. 1179872) e seguono le linee guida internazionali. Qualsiasi uso di embrioni umani deve essere riesaminato dagli organi etici e di governo competenti associati all'istituto di ricerca che utilizzano il presente protocollo.
1. Preparazione
<ol><li>Preparare i supporti e le piastre di re...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

Lo sviluppo del protocollo per la coltura degli embrioni umani attraverso l'impianto ha permesso agli scienziati di esplorare un tempo precedentemente inesplorate nellosviluppo 8,9. Qui, usiamo un sistema di coltura esteso per colturare gli embrioni umani e studiare la differenziazione trofoblasto precoce prima della formazione della placenta villous. I metodi descritti qui ci permettono di raccogliere diverse sottolinea TB da utilizzare nell'analisi a cella sing...

L'impianto umano e l'emergere della placenta precoce sono storicamente difficili da indagare e rimangono in gran parte sconosciuti perché i tessuti umani sono inaccessibili in questa fase quando la gravidanza è clinicamente inosservabile. I modelli animali sono inadeguati, in quanto la placentation umana ha le sue caratteristiche uniche rispetto ad altri mammiferi eutermici. Ad esempio, la placenta umana invade profondamente il decidua con alcune cellule trofoblaste che raggiungono almeno il terzo interno del miometrio uterino mentre altre cellule rimodellano le arterie a spirale uterina. Anche i nostri antenati evoluzionari più vicini, i primati non umani, mostrano differenze nella morfologia placenuale e nelle interazioni trofoblastiche con i tessuti decidualimaterni 1,2,3. Ottenere embrioni umani pre-impiantamenti in vitro non è stato possibile fino agli anni '80, quando la fecondazione clinica in vitro umana (IVF) è iniziata come pratica di routine per il trattamento dell'infertilità4. Ora, le blastociti umane possono essere coltivate in vitro per consentire la selezione di embrioni più vitali per il trasferimento, oltre a consentire test genetici sicuri. Il miglioramento delle tecniche di coltura degli embrioni, nonché il crescente uso della fecondazione in vitro hanno prodotto molti blastocici in eccesso che rimangono dopo che i cicli di trattamento del paziente sono stati completati. Con il consenso del paziente, l'approvazione dell'IRB e, con alcune restrizioni, queste blastocici possono essere utilizzate per studi di ricerca. Sono diventati una risorsa inestimabile che sono stati utilizzati per la derivazione delle cellule staminali embrionaliumane 5, comprendendo la transizione della massa cellulare interna alle cellule staminali embrionali6,7, e più recentemente, sono state culturezzate con successo fino al giorno (D) 13 per rimodellare l'impianto umano8,9. Utilizzando approcci omici a singola cellula recentemente sviluppati, l'accesso a questi tessuti embrionali umani in fase di impianto ha offerto opportunità uniche per descrivere i meccanismi molecolari che regolano questo processo di differenziazione cellulare altamente dinamico, che in precedenza eranoimpossibili da esplorare 10,11,12,13.
Qui, descriviamo i metodi utilizzati nella nostra recente pubblicazione caratterizzando la dinamica della differenziazione trofoblasa durante l'impianto umano12. Questo protocollo include il riscaldamento delle blastocità vetrificate, la coltura embrionale estesa fino al D12 dopo la fecondazione in vitro, la digestione ezimatica dell'embrione in singole cellule e la raccolta di cellule per i test a valle (Figura 1). Questo sistema di coltura estesa supporta lo sviluppo dell'embrione umano in fase di peri-impianto senza input materno e ricapitola la differenziazione trofoblasto che appare coerente con le osservazioni fatte da campioni statologici molti anni fa14,15,16,17. Durante l'impianto, la popolazione trofoblasa è costituita da almeno due tipi di cellule: il citotrophoblast mononucleato simile a un progenitore (CTB) e il sintootropoblast (STB) differenziato terminalemente e multinucleato. Al momento della digestione della trypsina, il CTB sono piccole cellule rotonde che sono morfologicamente indistinguibili da altre linee cellulari (Figura 2A, pannello sinistro). La separazione del CTB da altre linee cellulari, come l'epiblast e l'endoderma primitivo, può essere ottenuta con i loro profili trascrittori distinti rivelati dal sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Le cellule sincitiotrofoblast possono essere facilmente identificate come strutture di forma irregolare che sono significativamente più grandi rispetto agli altri tipi di cellule e si trovano principalmente alla periferia dell'embrione (Figura 2A, pannello centrale; Figura 2B, pannello sinistro). Le cellule trofoblaste migratorie (MTB) sono un'altra sottolinea trofoblasa trovata durante la coltura estesa degli embrioni e possono essere riconosciute come apparentemente allontanate dal corpo principale dell'embrione (Figura 2A, pannello a destra, Figura 2B, pannello destro). Il trofoblasto migratorio, pur esprimendo molti degli stessi marcatori del trofoblasto extra villous (EVT), non dovrebbe essere indicato come EVT, poiché le strutture villous nella placenta non sono emerse in questa fase molto precoce dello sviluppo.
Sperimentalmente, siamo stati in grado di raccogliere piccoli CTB e STB di grandi dimensioni che sono facilmente distinguibili dopo che gli embrioni sono stati digeriti in singole cellule a D8, D10 e D12 (Figura 2A,B). I trofoblasti migratori si presentano nelle fasi successive della coltura embrionale estesa e possono essere raccolti al D12 prima della digestione ezimatica dell'intero embrione (Figura 2A,B). Separando fenotipicamente queste tre sottolinea trofoblaste prima dell'analisi a singola cellula, possiamo identificare specifici marcatori trascrizioniomici e definire il ruolo biologico di ogni tipo di cellula. I citotropoblasti sono altamente prolifertivi e agiscono come cellule progenitrici nella fornitura delle linee differenziate STB e MTB10,11,12,13. I syncytiotrophoblast sono coinvolti nella produzione di ormoni placental per mantenere la gravidanza e possono anche essere responsabili degli embrioni che scavano nell'endometrio10,11,12,13. Il trofoblasto migratorio ha caratteristiche ancora più forti di un fenotipo invasivo e migratorio e sono probabilmente responsabili di una colonizzazione più profonda e più estesa dell'endometriouterino 10,11,12,13. Dopo aver definito la firma trascrittimica di ogni tipo di cellula, le analisi di clustering hanno anche rivelato due sottoinsiemi aggiuntivi di cellule che erano morfologicamente indistinguibili da CTB e avevano trascrittimi con caratteristiche di STB e MTB,rispettivamente 12. Queste cellule dello stadio intermedio sono probabilmente nel processo di differenziazione da CTB alle sottolinea MTB o STB e sarebbero state trascurate se gli embrioni fossero stati digeriti ciecamente e le cellule fossero state separate solo dal trascrimama.
Il protocollo qui descritto utilizza un sistema di coltura bidimensionale (2D) e potrebbe non essere ottimale per supportare lo sviluppo strutturale tridimensionale (3D), come suggerito da una recente pubblicazione che descrive un sistema di coltura 3Ddi recente sviluppo 13. Tuttavia, in questo sistema 2D la differenziazione del trofoblasto precoce sembra essere coerente con le osservazioni fatte da esemplari in vivo14,15,16,17. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per l'uso nel sistema di coltura 3D13 recentemente descritto con modifiche minime. Tutti i passaggi vengono eseguiti con una pipetta di micromanipolazione portatile con punte usa e getta disponibili in modo commerciale o una pipetta per bocca da una pipetta di vetro finemente tirata attaccata a tubi di gomma, un filtro e un boccaglio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

L'impianto umano, l'apposizione e l'adesione all'epitelia della superficie uterina e la successiva invasione della blastocisti nel decidua materno, è un evento biologico critico ma enigmatico che è stato storicamente difficile da studiare a causa di limitazioni tecniche ed etiche. L'impianto è iniziato dallo sviluppo del trophectoderm al trofoblasto precoce e dalla successiva differenziazione in sottolinea trofoblasto distinta. La differenziazione aberrante precoce del trofoblasto può portare a insufficienza di impianto, patologie placentiali, anomalie fetali e aborto spontaneo. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per consentire agli embrioni umani di crescere fino al giorno 13 dopo la fecondazione in vitro in assenza di tessuti materni, un periodo di tempo che comprende il periodo di impianto nell'uomo. Questo ha dato ai ricercatori l'opportunità di studiare l'impianto umano e ricapitolare le dinamiche della differenziazione trofoblasta durante questo periodo critico senza confondere le influenze materne ed evitare ostacoli intrinseci allo studio degli eventi di differenziazione precoce degli embrioni in vivo. Per caratterizzare diverse sottolinea trofoblastiche durante l'impianto, abbiamo adottato metodi di coltura estesi bidimensionali (2D) esistenti e sviluppato una procedura per digerire e isolare in modo esipetino e isolare diversi tipi di cellule trofoblaste per i test a valle. Gli embrioni se nessiti in condizioni 2D hanno una morfologia relativamente appiattita e possono essere non ottimali nella modellazione di architetture embrionali tridimensionali (3D) in vivo. Tuttavia, la differenziazione dei trofoblasti sembra essere meno influenzata, come dimostrato dai cambiamenti previsti della morfologia e dell'espressione genica nel corso della coltura estesa. Diverse sottolinea trofoblas, tra cui citotrophoblast, syncytiotrophoblast e trofoblast migratorio possono essere separati per dimensione, posizione e apparizione temporale, e utilizzati per ulteriore caratterizzazione o sperimentazione. L'analisi di queste cellule trofoblastiche precoci può essere determinante per comprendere l'impianto umano, nel trattamento di comuni patologie place-sina, e mitigare l'incidenza della perdita di gravidanza.

Gli embrioni sani hanno mostrato una proliferazione continua nel corso della coltura estesa (Figura 2B). Gli embrioni anomali cominciarono a ritrarsi dai loro bordi esterni e disintegrarsi (Figura 2C). Dalla nostra esperienza, circa il 75% degli embrioni è stato attaccato al fondo del piatto rivestito di fibronectina a 48 h e l'attaccamento è aumentato a circa il 90% da 72 h in coltura. Il successo dell'attaccamento degli embrioni può essere ampiamente influe...

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Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Qui, descriviamo un metodo per riscaldare le blastocisti umani vetrificati, maficandoli attraverso il periodo di impianto in vitro, digerindoli in singole cellule e raccogliendo cellule trofoblaste precoci per ulteriori indagini.

Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Molte gravidanze falliscono all'inizio dello sviluppo dell'embrione umano intorno ai sette o otto post-fecondazione. Questo protocollo offre agli investigatori l'opportunità di far crescere i conceptor umani in vitro durante questa misteriosa finestra di impianto. Questo ci permette di comprendere i meccanismi che sono alla base del successo dell'impianto umano e della formazione placentare precoce.L'uso di un sistema di coltura esteso per far crescere gli embrioni umani allo stadio di periimpianto in vitro è probabilmente l'unico modo per ottenere materiali autentici per studiare l'impianto e la differenziazione precoce dei trofoblasti. Questa tecnica semplice è uno strumento potente che ci consente di rispondere a molte domande fondamentali sullo sviluppo precoce umano. La ricerca condotta con l'uso di questo protocollo contribuirà in gran parte alla comprensione della perdita della gravidanza precoce, del fallimento ricorrente dell'impianto e delle patologie della placenta.A dimostrare la procedura sarà Deirdre Logsdon, dottorando di un laboratorio. Un giorno prima del riscaldamento dell'embrione, preparare i supporti e le piastre di recupero in una cappa sterile a flusso laminare. Riempire due piatti di lavaggio con coltura di organi center well con 500 microlitri di BM con 10%SPS, quindi coprire il BM con 500 microlitri di olio di coltura embrionale.In un piatto di coltura tissutale di 16 millimetri, strato otto millilitri di olio di coltura embrionale e ancorare 20 gocce di microlitri di BM con 10%SPS sul fondo. Equilibrare i piatti di lavaggio e la piastra di recupero in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, 6% di anidride carbonica e 5% di ossigeno per almeno quattro ore. Aliquota circa quattro millilitri di IVC 1 in un tubo a scatto da cinque millilitri e preparare un piatto di lavaggio con 500 microlitri di IVC 1 senza sovrapposizione di olio.Equilibrare il piatto e il tubo nell'incubatrice per almeno quattro ore. Diluire la fibronectina dal siero umano in PBS a 30 microgrammi per millilitro. Aprire la confezione di coverlip ben camerata facendo attenzione a non toccare i pozzi, quindi pipettare delicatamente 250 microlitri della fibronectina in ogni pozzo.Sostituire il coperchio sul coperchio e incubarlo a quattro gradi Celsius per 20-24 ore. Preparare la piastra di coltura estesa la mattina del riscaldamento dell'embrione. Recuperare lo scivolo di copertura a camera con fibronectina e posizionarlo nella cappa di flusso laminare.Quindi rimuovere la miscela di fibronectina con una pipetta da un millilitro e scartarla. Pipettare 300 microlitri dell'IVC 1 equilibrato in ogni pozzo e posizionare il coverslip nell'incubatore fino alla rimozione della zona pellucida. Dopo il riscaldamento e il recupero degli embrioni umani D5, valutali per la espansione e scatta foto di ogni embrione.Spostare ogni embrione in 500 microlitri di un mezzo di manipolazione tamponato MOPS con il 5%FCS. Quindi trattalo con la soluzione acida del Tirolo come descritto nel manoscritto testuale. Spostare immediatamente l'embrione con la zona di scioglimento in 300 microlitri di mezzo tamponato MOPS riscaldato per spegnere la soluzione del Tirolo.Quindi spostare l'embrione in un piatto centrale di tessuto d'organo contenente il BM equilibrato con 10%SPS sotto l'olio di coltura dell'embrione. Quindi riportare l'embrione alla goccia di recupero di 20 microliter. Spostare singolarmente gli embrioni nella piastra di lavaggio con il supporto IVC 1 equilibrato, quindi spostare attentamente ogni embrione in un pozzo del coperchio a camera, assicurandosi di tenere traccia dell'identificazione dell'embrione.Riportare il coperchio a camera in un'incubatrice impostata su 37 gradi Celsius, 6% di anidride carbonica e ossigeno atmosferico per due giorni. Al secondo giorno di crescita, esaminare attentamente l'attaccamento degli embrioni al microscopio e scambiare i media. Sapere quale embrione è attaccato al piatto toccando delicatamente il piatto.Per cambiare il supporto, rimuovere il coperchio e aspirare con cura 150 microlitri di IVC 1, facendo attenzione a non disturbare l'embrione collegato. Se un embrione non è ancora attaccato alla piastra, non scambiare il supporto perché il siero in IVC 1 aiimenterà in attaccamento. Pipettare lentamente 150 microlitri di supporti di coltura estesi equilibrati, IVC 2 in ogni pozzo e Sostituire il coperchio sul coperchio.Ha restituito con cura il coverslip a camera all'incubatore. Ripetere lo scambio di supporti e il controllo dell'allegato ogni giorno fino a quando gli embrioni non sono pronti per la fissazione o la digestione a singola cellula. Se la raccolta di supporti spesi è necessaria per ulteriori analisi, agganciare i 150 microlitri di IVC 1 rimossi in un tubo sterile a bassa legante da 0,5 millilitri.Lavare ogni embrione una volta con 200 microlitri di PBS, quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di tripina ad ogni pozzo. Riportare la coverslip a camera all'incubatrice per cinque minuti. Utilizzare una piccola pipetta o pipetta per la bocca finemente tirata per raccogliere una singola MTB, quindi utilizzare una pipetta più grande per dissociare delicatamente l'embrione aspirando su e giù.Continuare ad aspirare l'embrione delicatamente e ripetutamente utilizzando una punta di pipetta di diametro inferiore fino a quando l'embrione non è stato incubato per un totale di 10 minuti in tripina. Per eseguire la selezione di singole cellule, spostare le cellule dissociate attraverso gocce di lavaggio a 320 microliter di PBS e 0,1%PVP sotto olio di coltura embrionale, facendo attenzione a non perdere cellule. Dopo aver lavato le celle utilizzare una pipetta di vetro finemente tirata per selezionare una cella.Pipettare con cura la singola cella in un tubo sterile a bassa legante da 0,2 millilitri con un volume minimo di PBS e PVP. Aggancia singole celle libere in azoto liquido e conservale a -80 gradi Celsius per un ulteriore utilizzo. Embrioni sani hanno mostrato una continua proliferazione nel corso della coltura estesa, mentre embrioni anomali hanno iniziato a ritrarsi dai loro bordi esterni e disintegrarsi.All'ottavo giorno dopo la fecondazione, la maggior parte delle cellule negli embrioni erano citotrofiblasti o CTC, che erano positivi per il marcatore di trofoblasto GATA-3. Alla periferia dell'embrione, i CTC si stavano già differenziando in sincotrofiblasti multi-nucleati, che avevano un aspetto simile a un foglio e macchiati di positivo per l'uomo CGB. Al giorno 10, la formazione di cellule trophoblast migratorie positive del CGB era al massimo, il che è stato confermato dall'aumento della produzione di HCG in questo momento.Anche i trofoblasti migratori che macchiarono positivamente l'HLA-G iniziarono ad emergere e migrare lontano dal corpo dell'embrione. Al giorno 12, la differenziazione STB era in declino e la produzione di MTB divenne più prominente, suggerendo uno spostamento dell'enfasi dalla produzione di ormoni il giorno 10 alla migrazione cellulare il giorno 12. Questi cambiamenti possono essere osservati in un video time lapse del periodo di periimpianto.Il video mostra il collasso del blastocele, la formazione della STB e l'eventuale differenziazione e migrazione della MTB. La cosa più importante da tenere a mente quando si completa questa procedura è che si lavora con embrioni vivi sensibili ai cambiamenti di temperatura, osmolalità e pH. Ridurre al minimo la quantità di tempo in cui i piatti sono fuori dall'incubatrice è fondamentale per mantenere la salute degli embrioni.Dopo aver completato questa procedura, gli investigatori possono utilizzare singole cellule isolate per saggi di omica a singola cellula a valle, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e il sequenziamento della bisolfito dell'intero genoma per comprendere meglio i cambiamenti epigenetici e trascrittomici durante l'impianto umano e la formazione precoce di placenta.

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