Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

우리는 콜로라도 생식 의학 센터 (CCRM)의 많은 환자들이 연구를 위해 자신의 배아를 정중하게 기증한 것을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 카렌 마루니아크와 hCG 샘플 처리에 그들의 도움에 대한 CCRM의 임상 실험실뿐만 아니라, 고소 맥코믹과 그녀의 임상 IVF 배아 팀이 배아 수집, 저장, 추적 및 기부에 대한 도움을 주셔서 감사합니다. 자금 조달은 CCRM에 의해 내부적으로 제공되었습니다.

모든 인간 배아는 연구에 사용하기 위한 동의하에 기증되었습니다. 확장된 인간 배아 문화에 대한 프로토콜은 서부 기관 검토 위원회 (연구 번호 1179872)에 의해 승인되었으며 국제 지침을 따릅니다. 인간 배아의 사용은 이 프로토콜을 사용하여 연구 기관과 관련된 적절한 윤리 및 관리 기관에 의해 검토되어야 합니다.
1. 준비
<ol><li>멸균 라미나르 플로우 후드에서 배아 온난?...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

이식을 통해 인간 배아를 배양하는 프로토콜의 개발은 과학자들이 개발8,,9에서이전에 미지의 시간을 탐구할 수 있게 해 주었다. 여기서, 우리는 인간 배아를 배양하고 villous 태반의 형성 전에 초기 trophoblast 분화를 연구하기 위하여 확장된 배양 시스템을 이용합니다. 여기에 설명된 방법은 다운스트림 단세포 분석에 사용하기 위해 다른 TB 하위계를 수?...

인간의 이식과 초기 태반의 출현은 역사적으로 어렵고 임신이 임상적으로 감지 할 수없는 경우 이 단계에서 인간의 조직에 접근 할 수 없기 때문에 크게 알려지지 않았습니다. 인간 태반은 다른 유테리안 포유류에 비해 고유 한 특징을 가지고 있기 때문에 동물 모델은 부적절합니다. 예를 들어, 인간의 태반은 다른 세포가 자궁 나선형 동맥을 리모델링하는 동안 자궁 근막의 적어도 내부 3 분의 1에 도달하는 일부 영양 세포와 데시두아 깊숙이 침입한다. 심지어 우리의 가장 가까운 진화 조상, 비 인간 영장류, 모계 decidual조직1,,2,,3과태반 형태와 열대 성술 상호 작용의 차이를 보여줍니다 . 체외에서 이식 전 인간 배아를 얻는 것은 1980년대까지 는 임상 인간이 체외 수정(IVF)이불임치료를 위한 일상적인 관행으로 시작될 때까지 가능하지 않았다. 지금, 인간 blastocysts는 전송을 위한 더 실행 가능한 태아의 선택을 허용하기 위하여 시험관에서 성장될 수 있고, 뿐만 아니라 안전한 유전 시험을 가능하게 합니다. 배아 배양 기술의 개선뿐만 아니라 IVF의 사용이 증가함에 따라 환자의 치료 주기가 완료된 후에도 남아있는 많은 잉여 배반증을 산출했습니다. 환자의 동의, IRB 승인 및 특정 제한으로 이러한 배반구는 연구 연구에 사용될 수 있습니다. 그(것)들은 인간 배아 줄기 세포의 유도를 위해 이용된 귀중한 자원이 되었다5,배아 줄기 세포로 내부 세포 질량의 전이를이해6,,7,그리고 더 최근에, 성공적으로 인간이식8,,9를리모델링하기 위하여 일 (D) 13까지 배양되었다. 최근에 개발된 단일 세포 오믹스 접근법을 활용함으로써, 이러한 이식 단계 인간 배아 조직에 대한 접근은 이전에는 10,11,12,,13을탐구하는 것이 불가능했던 이 고동적인 세포 분화 과정을 조절하는 분자 메커니즘을 설명할 수 있는 독특한 기회를 제공했다.,,
여기서, 우리는 인간이식(12)동안 트로포블라스트 분화의 역학을 특징으로 하는 최근 간행물에 사용된 방법을 설명한다. 본 프로토콜은 유리화된 blastocysts의 온난화, D12 포스트 IVF까지 확장된 배아 배양, 단일 세포로의 배아의 효소 소화, 하류 분석에 대한 세포 수집을포함한다(도 1). 이러한 확장배양 시스템은 모계 입력 없이 peri-이식 단계 인간 배아 발달을 지원하고 수년 전 조직학적 표본으로부터 이루어진 관찰과 일치하는 트로포블라스트 분화를 재구성하여14년 전,,15,,16,,17을지원합니다. 이식 하는 동안, trophoblast 인구는 적어도 두 개의 세포 유형으로 구성: 단핵 된 선조 같은 cytotrophoblast (CTB) 그리고 말단 분화, 다핵 싱크itiotrophoblast (STB). 트립신 소화시 CTB는 다른 세포 계보와 형태학적으로 구별할 수 없는 작고 둥근 세포입니다(도2A,왼쪽 패널). 에피블라스트 및 원시 적 엔데담과 같은 다른 세포 계보로부터 CTB의 분리는 단세포 RNA 염기서열에 의해 드러난 뚜렷한 전사 프로파일에 의해 달성될 수 있다. Syncytiotrophoblast 세포는 쉽게 다른 세포 유형보다 상당히 큰 불규칙한 모양의 구조로 쉽게 식별 될 수 있으며 주로 배아의 주변에 위치(도 2A,중간 패널; 그림 2B,왼쪽 패널). 철새 트로포블라스트 세포(MTB)는 배아 확장 배양 중에 발견되는 또 다른 트로포블라스트 서브라인이며 배아의 본체에서 멀어지는 것처럼 인식될 수있다(도 2A,오른쪽 패널, 도 2B,오른쪽 패널). 철새 트로포블라스트는 여분의 빌루스 트로포블라스트 (EVT)와 같은 마커의 많은 표현하지만, 태반의 villous 구조는 개발의 이 초기 단계에서 등장하지 않았기 때문에 EVT로 언급되어서는 안됩니다.
실험적으로, 우리는 배아가 D8, D10 및 D12(그림2A, B)에서단일 세포로 소화된 후에 쉽게 구별할 수 있는 작은 CTB 및 큰 STB를 수집할 수 있었습니다. 철새 열대성 세포는 확장된 배아 배양의 후기 단계에서 발생하며 전체 배아의 효소 소화 전에 D12에서 수집될 수있다(그림 2A, B). 단일 세포 분석 전에 이러한 3개의 트로포블라스트 하위계를 전형적으로 분리함으로써, 우리는 특정 전사 마커를 식별하고 각 세포 유형의 생물학적 역할을 정의할 수 있다. 세포로포스트는 매우 증식되어 있으며 STB 및 MTB 분화 혈통10,11,,,12,,13을공급하는 선조 세포역할을 한다. Syncytiotrophoblast는 임신을 유지하기 위하여 태반 호르몬을 생산에 관여하고 또한 자궁 내측으로 잠복하는 태아에 책임 있을 지도 모릅니다10,,11,,12,,13. 철새 트로포블라스트는 침략적이고 철새 현상형의 더 강한 특징을 가지고 있으며 자궁 내막관10,11,12,13의더 깊고 광범위한 식민지화를담당할가능성이 높습니다.,, 각 세포 유형의 전사 적 서명을 정의 한 후, 클러스터링 분석은 또한 CTB와 형태학적으로 구별할 수 없는 세포의 2개의 추가 하위 집합을 밝혔으며 각각12개의STB 및 MTB의 특징을 가진 전사를 가졌다. 이 중간 단계 세포는 CTB에서 MTB 또는 STB 하위라인으로 분화하는 과정에서 가능성이 높으며 배아가 맹목적으로 소화되고 세포가 전사에 의해단독으로 분리되었다면 간과되었을 것입니다.
여기서 설명된 프로토콜은 2차원(2D) 배양 시스템을 활용하고 새로 개발된 3D 배양시스템(13)을설명하는 최근 간행물에 의해 제안된 바와 같이 3차원(3D) 구조 개발을 지원하는 데 최적이 아닐 수 있다. ,그럼에도 불구하고, 이 2D 시스템에서 초기 트로포블라스트의 분화는 생체 내표본(14,15,16,17)에서이루어진관찰과일치하는 것으로 보인다., 또한 이러한 프로토콜은 최소한의 변경으로 최근에 설명된 3D 배양시스템(13)에서의 사용에 맞게 용이하게 적용될 수 있다. 모든 단계는 고무 튜브, 필터 및 마우스피스에 부착 된 미세하게 당겨진 유리 파이펫에서 시판 되는 일회용 팁 또는 입 파이펫이있는 휴대용 마이크로 조작 파이펫으로 수행됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

인간의 이식, 자궁 표면 상피에 대한 정착 및 접착및 모계 데시두아에 배반증이 잇따라 침입한 것은 기술적, 윤리적 한계로 인해 역사적으로 연구하기가 어려웠던 중요하면서도 수수께끼같은 생물학적 사건이다. 이식은 초기 트로포 블라스트에 트로페토데름의 개발과 뚜렷한 열대 성세포 하위로 후속 분화에 의해 시작된다. 비정상적인 초기 트로포블라스트 분화는 이식 실패, 태반 병리, 태아 이상 및 유산으로 이어질 수 있습니다. 최근에는 인간 배아가 인체의 이식 기간을 포괄하는 시동 조직부재에서 체외에서 13일째까지 자라도록 하는 방법이 개발되었다. 이것은 연구원에게 인간 이식을 조사하고 모성의 영향을 혼동하고 생체 내초기 배아 분화 사건을 연구하기 위하여 내재된 장애물을 피하지 않고 이 중요한 기간 도중 trophoblast 분화의 역학을 재정의할 기회를 주었습니다. 이식 중 상이한 트로프토블라스트 서브라인지를 특성화하기 위해 기존의 2차원(2D) 확장 배양 방법을 채택하고 하류 분해를 위해 다양한 유형의 트로피컬블라스트 세포를 효소적으로 소화하고 분리하는 절차를 개발했습니다. 2D 조건에서 배양된 배아는 비교적 평평한 형태를 가지며 생체 내 3차원(3D) 배아 아키텍처에서 모델링에 최적이 아닐 수 있다. 그러나, trophoblast 분화는 확장된 문화의 과정을 통해 예상된 형태학 및 유전자 발현 변경에 의해 입증된 바와 같이 보다 적게 영향을 받는 것처럼 보입니다. 사이토트로토블라스트, 싱크티오트로포블라스트 및 철새 트로포블라스트를 포함한 다른 열대성 아열대는 크기, 위치 및 측두적인 출현으로 구분될 수 있으며, 추가 특성화 또는 실험에 사용될 수 있다. 이 초기 trophoblast 세포의 조사는 일반적인 태반 병리를 취급하고, 임신 손실의 부각을 완화하는 인간 이식을 이해하는 중요한 역할을 할 수 있습니다.

건강한 배아는 확장된 배양(도2B)의과정을 통해 지속적인 증식을 나타냈다. 비정상적인 배아는 외부 가장자리에서 후퇴하기 시작했고붕괴(그림 2C). 우리의 경험에서, 배아의 대략 75%는 48 h에서 fibronectin 코팅 된 접시의 바닥에 부착하고 배양에서 약 90 %로 증가. 배아 부착의 성공은 크게 배반구의 초기 품질에 의해 영향을받을 수있다. 72h에 의해 부착되?...

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Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

많은 임신은 7 개 또는 8 후 수정 의 주위에 인간 적인 태아 발달에서 일찌기 실패합니다. 이 프로토콜은 이 신비한 이식 기간 동안 시험관에서 인간 개념가를 성장시킬 수 있는 기회를 연구원에게 제공합니다. 이것은 우리가 인간 이식및 초기 태반 대형의 성공을 뒷받침하는 기계장치를 이해할 수 있게 합니다.생체 외에서 peri 이식 단계를 성장하기 위해 확장 된 배양 시스템을 사용하는 것은 아마도 이식 및 초기 트로피후블라스트 분화를 연구하기 위해 본격적인 재료를 얻을 수있는 유일한 방법입니다. 이 간단한 기술은 인간의 초기 개발에 대한 많은 근본적인 질문에 대답 할 수있는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜의 사용으로 수행 된 연구는 주로 초기 임신 손실, 재발 이식 실패 및 태반 병리의 이해에 기여할 것입니다.절차를 시연하는 것은 실험실에서 박사 과정 학생인 Deirdre Logsdon이 될 것입니다. 배아 온난화 하루 전에 멸균 라미나르 플로우 후드로 미디어 및 복구 플레이트를 준비합니다. BM 500 마이크로리터로 2개의 센터 잘 장기 배양 세척 접시를 10%SPS로 채운 다음 BM을 배아 배양 등급 오일 500마이크로리터로 커버합니다.16mm 조직 배양 접시에서, 배아 배양 오일의 8 밀리리터를 층과 바닥에 10%SPS와 BM의 20 마이크로 리터 방울을 앵커. 37섭씨, 이산화탄소 6%, 산소 5%를 4시간 이상 인큐베이터에 보관합니다. Aliquot 는 IVC 1의 약 4 밀리리터를 5 밀리리터 스냅 캡 튜브에 넣고 오일 오버레이 없이 IVC 1의 500 마이크로리터로 한 개의 세척 접시를 준비합니다.인큐베이터의 접시와 튜브를 적어도 4시간 동안 평형화합니다. PBS의 인간 혈청에서 밀리리터당 30 마이크로그램으로 섬유넥틴을 희석시킵니다. 우물을 만지지 않도록 주의하는 8 개의 잘 챔버 커버 슬립 패키지를 열고 각 우물에 섬유 네틴의 250 마이크로 리터를 부드럽게 피펫하십시오.커버슬립의 뚜껑을 교체하고 섭씨 4도에서 20~24시간 동안 배양합니다. 배아 온난화의 아침에 확장 된 배양 판을 준비합니다. 챔버 커버 슬립을 fibronectin으로 검색하고 라미나르 플로우 후드에 놓습니다.그런 다음 1 밀리리터 파이펫으로 섬유네틴 혼합물을 제거하고 폐기하십시오. 피펫 300 마이크로리터의 EVC 1을 각 우물에 넣고 표지 슬립을 인큐베이터에 넣고 조나 펠루치다를 제거할 때까지 인큐베이터에 넣습니다. D5 인간 배아의 온난화와 회복 후, 재확장을 위해 평가하고 각 배아의 사진을 찍습니다.각 배아를 5%FCS로 MOPS 버퍼처리 매체의 500마이크로리터로 이동합니다. 그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 산성 Tyrode의 용액으로 처리합니다. 용해 구역으로 배아를 300 마이크로리터로 즉시 이동하여 티로데의 용액을 담금질합니다.그런 다음 배아 배양 등급 오일하에서 10%SPS로 평형 BM을 함유하는 중앙 웰 장기 조직 접시로 배아를 이동한다. 그런 다음 배아를 20 마이크로리터 회복 드롭으로 되돌려 놓습니다. 개별적으로 계형IVC 1 매체를 사용하여 배아를 세척 접시로 옮은 다음 각 배아를 챔버 커버슬립의 우물로 조심스럽게 이동하여 배아 식별을 추적합니다.챔버 커버슬립을 섭씨 37도, 이산화탄소 6%, 대기산소로 설정된 인큐베이터로 2일 간 반납한다. 2일째되는 날, 현미경으로 배아의 부착을 주의 깊게 살펴보고 미디어를 교환한다. 접시를 부드럽게 눌러 접시에 부착되는 배아를 알 수 있습니다.미디어를 변경하려면 뚜껑을 제거하고 IVC 1의 150 마이크로리터를 조심스럽게 흡인하여 부착된 배아를 방해하지 않도록 주의하십시오. 배아가 아직 접시에 부착되지 않은 경우 IVC 1의 혈청이 부착에 도움이 되기 때문에 미디어를 교환하지 마십시오. 평형 확장 배양 매체의 150 마이크로리터를 천천히 피펫, IVC 2는 각 우물에 넣고 커버슬립의 뚜껑을 교체합니다.조심스럽게 챔버 커버 슬립을 인큐베이터로 돌려보냈다. 배아가 고정 또는 단세포 소화를 위한 준비가 될 때까지 매일 미디어 교환 및 첨부 검사를 반복합니다. 추가 분석을 위해 소비된 미디어의 수집이 필요한 경우, 스냅제거된 IVC 1의 150마이크로리터를 멸균 저구속 0.5 밀리리터 튜브로 동결한다.PBS의 200 마이크로 리터로 각 배아를 한 번 씻은 다음 각 우물에 트립신 용액 200 마이크로 리터를 추가하십시오. 챔버 커버슬립을 인큐베이터에 5분간 반납합니다. 작은 파이펫이나 잘게 당겨진 입 파이펫을 사용하여 개별 MTB를 수령한 다음 더 큰 파이펫을 사용하여 배아를 위아래로 부드럽게 해리시합니다.배아가 트립신에서 총 10분 동안 배양될 때까지 더 작은 직경의 파이펫 팁을 사용하여 배아를 부드럽게 그리고 반복적으로 흡입합니다. 단일 세포 선택을 수행하기 위해, 접합 된 세포를 통해 320 마이크로 리터 세척 방울및 배아 배양 오일에서 0.1 %의 PVP를 이동하여 세포를 잃지 않도록주의하십시오. 세포를 세척한 후 잘게 당겨진 유리 파이펫을 사용하여 하나의 셀을 선택합니다.PBS및 PVP의 최소 부피와 멸균 0.2 밀리리터 낮은 바인드 튜브에 단일 셀을 조심스럽게 피펫. 액체 질소에 무료 단일 세포를 스냅 하 고 추가 사용을 위해 부정적인 80 섭씨에 저장. 건강한 배아는 확장된 문화의 과정을 통해 지속적인 증식을 보였고, 비정상적인 배아는 바깥쪽 가장자리에서 후퇴하고 분해되기 시작했습니다.8일째 에 수정, 배아에 있는 대부분의 세포는 사이토트로포블라스트 또는 CTBs, 그 trophoblast 마커 GATA-3에 대 한 긍정적인. 배아의 주변에서 CTB는 이미 외모와 같은 시트를 가지고 인간 CGB에 대한 양성 얼룩이있는 다중 핵 싱크티오트로포블라스트로 분화했습니다. 10일째, CGB 양성 철새 대열 세포의 형성은 최대였고, 이는 현재 HCG 생산의 급증에 의해 확인되었다.HLA-G에 대 한 긍정적인 염색 철새 trophoblasts, 또한 등장 하 고 배아 몸에서 멀리 이동 하기 시작. 12일째까지 STB 분화는 감소하고 MTB 생산이 더욱 두드러졌으며, 10일째에 호르몬 생산에서 세포 이동으로 12일째에 중점을 두는 것을 시사했습니다. 이러한 변화는 페리 이식 기간의 시간 경과 비디오에서 관찰될 수 있다.비디오는 blastocele의 붕괴, STB의 형성 및 MTB의 최종 분화 및 마이그레이션을 보여줍니다. 이 절차를 완료할 때 명심해야 할 가장 중요한 것은 온도, 진동 및 pH의 변화에 민감한 살아있는 배아와 함께 작업하고 있다는 것입니다. 배아가 배아 건강 상태를 유지하는 데 중요한 배식기에서 나오는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.이 절차를 완료한 후, 조사자들은 단세포 RNA 염기서열 분석 및 전체 게놈 편심염 시퀀싱과 같은 하류 단일 세포 오믹스 분석법에 대해 격리된 단일 세포를 사용하여 인간 이식 및 초기 태반 형성 중 후생유전학 및 전사적 변화를 더 잘 이해할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

연구

생물학

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

초기 치킨 태아의 성장 팩터 - 코팅 비즈 배치

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

HH 스테이지 10 치킨 태아의 비켜 Electroporations에서

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

칙 태아의 단일 세포 Transfection

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...