Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Vi ønsker å anerkjenne de mange pasientene ved Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) som nådig har donert sine embryoer for forskning. Vi vil også takke Karen Maruniak og det kliniske laboratoriet ved CCRM for deres hjelp til å behandle hCG-prøver, samt Sue McCormick og hennes kliniske IVF embryologiteam ved CCRM for deres hjelp med embryoinnsamling, lagring, sporing og donasjon. Finansieringen ble gitt internt av CCRM.

Alle menneskelige embryoer har blitt donert med samtykke til bruk i forskning. Protokoller for utvidet menneskelig embryokultur er godkjent av Western Institutional Review Board (studie nr. 1179872) og følger internasjonale retningslinjer. Enhver bruk av menneskelige embryoer må gjennomgås av de aktuelle etiske og styrende organer knyttet til forskningsinstitusjonen ved hjelp av denne protokollen.
1. Forberedelse
<ol><li>Forbered media og restitusjonsplater en dag før embryooppvarming i ...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

Utviklingen av protokollen til kultur menneskelige embryoer gjennom implantasjon har tillatt forskere å utforske en tidligere ukjent tid i utvikling8,9. Her bruker vi et utvidet kultursystem for å dyrke menneskelige embryoer og studere tidlig trophoblast differensiering før dannelsen av vill. Metodene som er beskrevet her tillater oss å samle forskjellige TB-underlinjer for bruk i nedstrøms encelleanalyse. Dette arbeidet gir det vitenskapelige samfunnet en s...

Menneskelig implantasjon og fremveksten av den tidlige morkaken er historisk vanskelig å undersøke og forblir i stor grad ukjent fordi menneskelig vev er utilgjengelig på dette stadiet når graviditet er klinisk umulig å oppdage. Dyremodeller er utilstrekkelige, da menneskelig placentation har sine egne unike egenskaper sammenlignet med andre eutherian pattedyr. For eksempel invaderer menneskelig placenta dypt inn i decidua med noen trophoblastceller som når minst den indre tredjedelen av livmormyometriummens andre celler omformer livmorspiralarteriene. Selv våre nærmeste evolusjonære forfedre, de ikke-menneskelige primater, viser forskjeller i placenta morfologi og trophoblast interaksjoner med mors decidual vev1,,2,,3. Å oppnå preimplantasjon humane embryoer in vitro var ikke mulig før på 1980-tallet da klinisk human in vitro befruktning (IVF) startet som en rutinemessig praksis for behandling av infertilitet4. Nå kan menneskelige blastocysts dyrkes in vitro for å tillate valg av mer levedyktige embryoer for overføring, samt muliggjøre sikker genetisk testing. Forbedring i embryokulturteknikker, samt den økende bruken av IVF har gitt mange overskuddsblastocyster som gjenstår etter at pasientens behandlingssykluser er fullført. Med pasientens samtykke, IRB-godkjenning, og med visse restriksjoner, kan disse blastocystene brukes til forskningsstudier. De har blitt en uvurderlig ressurs som ble brukt til avledning av humane embryonalestamceller 5,forstå overgangen av indre cellemasse til embryonalestamceller 6,7,og mer nylig, har blitt vellykket dyrket til dag (D) 13 å ombygge menneskelig implantasjon8,9. Ved å bruke nylig utviklede encellede omics tilnærminger, har tilgangen til disse implantasjonsstadiet menneskelig embryovev tilbudt unike muligheter til å beskrive molekylære mekanismer som regulerer denne svært dynamiske cellediensisjonsprosessen, som tidligere var umulig åutforske 10,11,12,13.
Her beskriver vi metodene som brukes i vår nylige publikasjon som karakteriserer dynamikken i trofoblastdilatering under menneskelig implantasjon12. Denne protokollen inkluderer oppvarming av vitrifiserte blastocysts, utvidet embryokultur opp til D12 post IVF, enzymatisk fordøyelse av embryoet i enkeltceller, og cellesamling for nedstrøms analyser (figur 1). Dette utvidede kultursystemet støtter peri-implantasjonsstadium menneskelig embryoutvikling uten mors innspill og rekavalerer trophoblast differensiering som ser ut til å være i samsvar med observasjonene fra histologiske prøver for mange årsiden 14,15,16,17. Under implantasjon består trofoblastpopulasjonen av minst to celletyper: mononuklet stamcellelignende cytotrophoblast (CTB) og terminalt differensiert, multinuklert syncytiotrophoblast (STB). Ved trypsin fordøyelsen er CTB små, runde celler som er morfologisk umulig å skille fra andre cellelinjer (Figur 2A, venstre panel). Separasjon av CTB fra andre cellelinjer, som epiblast og primitiv endoderm, kan oppnås ved deres distinkte transkripsjonsprofiler avslørt ved encellede RNA-sekvensering. Syncytiotrophoblast celler kan lett identifiseres som uregelmessige formede strukturer som er betydelig større enn de andre celletypene og hovedsakelig ligger i periferien av embryoet (Figur 2A, midtpanel; Figur 2B, venstre panel). Trekkfugl trophoblastceller (MTB) er en annen trophoblast sublineage funnet under embryo utvidet kultur og kan gjenkjennes som tilsynelatende beveger seg bort fra hoveddelen av embryoet (Figur 2A, høyre panel, Figur 2B, høyre panel). Trekktrophoblast, selv om de uttrykker mange av de samme markørene som ekstra villous trophoblast (EVT), bør ikke refereres til som EVT, siden de villelige strukturene i morkaken ikke har dukket opp på dette svært tidlige utviklingsstadiet.
Eksperimentelt var vi i stand til å samle små CTB og store STB som er lett skilles etter embryoer er fordøyd i enkeltceller ved D8, D10, og D12 (Figur 2A, B). Trekktrofoblaster oppstår i de senere stadiene av utvidet embryokultur og kan samles ved D12 før enzymatisk fordøyelse av hele embryoet (figur 2A, B). Ved å fenotypisk skille disse tre trophoblast-underlinjene før enkeltcelleanalyse, kan vi identifisere spesifikke transkripsjonsmiske markører og definere den biologiske rollen til hver celletype. Cytotrophoblast er svært proliferative og fungerer som stamceller i å levere STB og MTB differensierteavstamninger 10,,11,,12,,13. Syncytiotrophoblast er involvert i å produsere placentahormoner for å opprettholde graviditet og kan også være ansvarlig for embryoene som graver seg inn i endometrium10,11,12,13. Trekkfugltrophoblast har enda sterkere trekk ved en invasiv, migrerende fenotype og er sannsynligvis ansvarlig for dypere og mer omfattende kolonisering av livmoren endometrium10,11,12,13. Etter å ha definert transkripsjonssignaturen for hver celletype, har klyngeanalyser også avdekket to ekstra undergrupper av celler som var morfologisk umulig å skille fra CTB og hadde transkripsjoner med funksjoner i STB og MTB,henholdsvis 12. Disse mellomliggende fasecellene er sannsynligvis i ferd med å differensiere fra CTB til enten MTB- eller STB-underlinjene og ville ha blitt oversett hvis embryoer ble blindt fordøyd og cellene ble separert av transkripsjon alene.
Protokollen som er beskrevet her benytter et todimensjonalt (2D) kultursystem og er kanskje ikke optimal for å støtte tredimensjonal (3D) strukturell utvikling, som foreslått av en nylig publikasjon som beskriver et nyutviklet 3D-kultursystem13. Likevel, i dette 2D-systemet differensiering av tidlig trofoblast synes å være i samsvar med observasjoner gjort fra in vivo prøver14,15,16,17. Denne protokollen kan også enkelt tilpasses bruken i det nylig beskrevne 3D-kultursystemet13 med minimale endringer. Alle trinnene utføres med en håndholdt mikromanipuleringpipette med kommersielt tilgjengelige engangsspisser eller en munnpipette fra en fin trukket glasspipette festet til gummirør, et filter og et munnstykke.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

Menneskelig implantasjon, apposisjon og vedheft til livmoroverflaten epitelia og påfølgende invasjon av blastocyst inn i mors decidua, er en kritisk, men gåtefull biologisk hendelse som har vært historisk vanskelig å studere på grunn av tekniske og etiske begrensninger. Implantasjon initieres ved utvikling av trophectoderm til tidlig trofoblast og påfølgende differensiering i distinkte trophoblast-underlinjer. Avvikende tidlig trophoblast differensiering kan føre til implantasjonssvikt, placentapatologier, føtale abnormiteter og abort. Nylig har metoder blitt utviklet for å tillate menneskelige embryoer å vokse til dag 13 post-befruktning in vitro i fravær av mors vev, en tidsperiode som omfatter implantasjonsperioden hos mennesker. Dette har gitt forskere muligheten til å undersøke menneskelig implantasjon og rekafulere dynamikken i trophoblast differensiering i denne kritiske perioden uten forvirrende mors påvirkninger og unngå iboende hindringer for å studere tidlige embryodilateringshendelser in vivo. For å karakterisere ulike trophoblast-underlinjer under implantasjon, har vi vedtatt eksisterende todimensjonale (2D) utvidede kulturmetoder og utviklet en prosedyre for å enzymatisk fordøye og isolere ulike typer trofoblastceller for nedstrøms analyser. Embryoer dyrket i 2D-forhold har en relativt flat morfologi og kan være suboptimal i modellering in vivo tredimensjonale (3D) embryonale arkitekturer. Trophoblast differensiering synes imidlertid å være mindre påvirket som demonstrert av forventet morfologi og genuttrykksendringer i løpet av utvidet kultur. Ulike trophoblast underordnede, inkludert cytotrophoblast, syncytiotrophoblast og trekktrophoblast kan skilles etter størrelse, plassering og temporal fremvekst, og brukes til videre karakterisering eller eksperimentering. Undersøkelse av disse tidlige trofoblastcellene kan være medvirkende til å forstå menneskelig implantasjon, behandle vanlige placentapatologier og redusere forekomsten av graviditetstap.

Friske embryoer viste fortsatt spredning i løpet av utvidet kultur (Figur 2B). Unormale embryoer begynte å trekke seg tilbake fra sine ytre kanter og gå i oppløsning (figur 2C). Fra vår erfaring ble ca 75% av embryoene festet til bunnen av fibronectin belagt parabolen ved 48 timer og vedlegget økte til ca 90% av 72 timer i kultur. Suksessen til embryovedlegg kan i stor grad påvirkes av den opprinnelige kvaliteten på blastocysts. Embryoer som ikke er fest...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Her beskriver vi en metode for oppvarming av vitrifiserte humane blastocysts, culturing dem gjennom implantasjonsperioden in vitro, fordøye dem i enkeltceller og samle tidlige trophoblast celler for videre undersøkelse.

Enkeltcellesamling av trofoblastceller i Peri-implantasjonsstadium humane embryoer

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Mange graviditeter mislykkes tidlig i menneskelig embryoutvikling rundt syv eller åtte etter befruktning. Denne protokollen gir muligheter til å undersøke å vokse menneskelige konseptører in vitro under dette mystiske implantasjonsvinduet. Dette gjør at vi kan forstå mekanismene som underbygger suksessen til menneskelig implantasjon og tidlig placentadannelse.Ved hjelp av et utvidet kultursystem for å vokse peri-implantasjon stadium menneskelige embryoer in vitro er trolig den eneste måten å få autentiske materialer til å studere implantasjon og tidlig trophoblast differensiering. Denne enkle teknikken er et kraftig verktøy som tillater oss å svare på mange grunnleggende spørsmål om menneskelig tidlig utvikling. Forskning utført ved bruk av denne protokollen vil i stor grad bidra til forståelsen av tidlig graviditetstap, tilbakevendende implantasjonssvikt og placentapatologiene.Demonstrerte prosedyren vil være Deirdre Logsdon, ph.d.-studenten fra et laboratorium. En dag før embryooppvarming, forberede media og utvinning plater i en steril laminær strømningshette. Fyll to senterbrønnorgankulturvaskeretter med 500 mikroliter BM med 10% SPS, og dekk deretter BM med 500 mikroliter embryokulturklasseolje.I en 16 millimeter vev kultur rett, lag åtte milliliter embryo kultur olje og anker 20 mikroliter dråper BM med 10% SPS til bunnen. Likevekt oppvasken og restitusjonsplaten i en inkubator ved 37 grader Celsius, 6 % karbondioksid og 5 % oksygen i minst fire timer. Aliquot ca fire milliliter IVC 1 i en fem milliliter snap cap tube og forberede en vaskeskål med 500 mikroliter IVC 1 uten oljeoverlegg.Likevekt oppvasken og røret i inkubatoren i minst fire timer. Fortynn fibronectin fra humant serum i PBS til 30 mikrogram per milliliter. Åpne de åtte godt kamret dekkslip pakken tar vare på ikke å berøre brønnene, deretter forsiktig pipette 250 mikroliter av fibronectin i hver brønn.Sett lokket på dekkslippen og inkuber det ved fire grader Celsius i 20 til 24 timer. Forbered den utvidede kulturplaten om morgenen med embryooppvarming. Hent den kamrede dekselet slip med fibronectin og plasser den i laminær strømningshette.Fjern deretter fibronectinblandingen med en en milliliter pipette og kast den. Pipette 300 mikroliter av den likevektede IVC 1 i hver brønn og plasser dekkslippen i inkubatoren til fjerning av zona pellucida. Etter oppvarming og gjenoppretting av D5 menneskelige embryoer, vurdere dem for re-utvidelse og ta bilder av hvert embryo.Flytt hvert embryo til 500 mikroliter av et MOPS bufret håndteringsmedium med 5 %FCS. Behandle den deretter med sur Tyrodes løsning som beskrevet i tekstmanuskriptet. Flytt umiddelbart embryoet med oppløsningszonaen i 300 mikroliter med oppvarmede MOPS bufret medium for å slukke Tyrodes løsning.Deretter flytter du embryoet inn i en sentral brønnorganvevsrett som inneholder den likevektede BM med 10% SPS under embryokulturen. Deretter returnerer embryoet til 20 mikroliter utvinningsfallet. Flytt embryoene individuelt til vaskefatet med det likevektede IVC 1-mediet, og flytt deretter forsiktig hvert embryo til en brønn av den kamret dekkslippen, og sørg for å holde styr på embryoidentifikasjonen.Returner den kamret dekkslips til en inkubator satt til 37 grader Celsius, 6% karbondioksid og atmosfærisk oksygen i to dager. Ved utvekst dag to, nøye undersøke vedlegg av embryoene under mikroskopet og utveksle media. Vet hvilket embryo som er festet til parabolen ved å trykke forsiktig på platen.For å bytte media, fjern lokket og aspirer forsiktig 150 mikroliter av IVC 1, og ta vare på å ikke forstyrre det vedlagte embryoet. Hvis et embryo ennå ikke er festet til platen, må du ikke bytte ut media fordi serumet i IVC 1 vil hjelpe til med vedlegg. Pipette 150 mikroliter med likevektsutvidede kulturmedier, IVC 2 inn i hver brønn og Sett lokket på dekkslipsen.Returnerer forsiktig den kamret dekkslipsen til inkubatoren. Gjenta medieutveksling og vedleggskontroll hver dag til embryoer er klare for fiksering eller encellet fordøyelse. Hvis innsamling av brukte medier er nødvendig for videre analyse, snap fryse 150 mikroliter av fjernet IVC 1 i en steril lav bind 0,5 milliliter rør.Vask hvert embryo en gang med 200 mikroliter PBS, og tilsett deretter 200 mikroliter trypsinløsning til hver brønn. Sett den kamret dekkslipsen tilbake til inkubatoren i fem minutter. Bruk en liten pipette eller fint trukket munnpipette for å plukke opp en individuell MTB og bruk deretter en større pipette for å forsiktig dissosiere embryoet ved å aspirere opp og ned.Fortsett å aspirere embryoet forsiktig og gjentatte ganger ved hjelp av en pipettespiss med mindre diameter til embryoet har blitt inkubert i totalt 10 minutter i trypsin. For å utføre enkeltcellevalg, flytt de dissosierte cellene gjennom 320 mikroliter vaskedråper pbs og 0,1% PVP under embryokulturolje, og ta vare på å ikke miste noen celler. Etter vasking cellene bruke en fint trukket glass pipette for å velge en celle.Pipette enkeltcellen forsiktig inn i et sterilt 0,2 milliliter lavt bindrør med minimalt volum PBS og PVP. Snap gratis enkeltceller i flytende nitrogen og lagre dem på negative 80 grader Celsius for videre bruk. Friske embryoer viste fortsatt spredning i løpet av utvidet kultur, mens unormale embryoer begynte å trekke seg tilbake fra sine ytre kanter og gå i oppløsning.På dag åtte etter befruktning var de fleste cellene i embryoene cytotrophoblast eller CTB- er, som var positive for trofoblastmarkøren GATA-3. I periferien av embryoet differensierte CTB-ene allerede i multikjernerte syncytiotrophoblaster, som hadde et ark som utseende og farget positivt for mennesker CGB. På dag 10 var dannelsen av CGB-positive trekktrophoblastceller maksimalt, noe som ble bekreftet av oppsvinget av HCG-produksjonen på dette tidspunktet.Trekktrofoblaster som farget positivt for HLA-G, begynte også å dukke opp og migrere bort fra embryokroppen. På dag 12 var STB differensiering i tilbakegang og MTB-produksjonen ble mer fremtredende, noe som tyder på et skifte av vekt fra hormonproduksjon på dag 10 til cellemigrasjon på dag 12. Disse endringene kan observeres i en tidsforløpsvideo av peri-implantasjonsperioden.Videoen viser sammenbruddet av blastocele, dannelsen av STB, og eventuell differensiering og migrasjon av MTB. Det viktigste å huske på når du fullfører denne prosedyren er at du arbeider med levende embryoer som er følsomme for endringer i temperatur, osmolalitet og pH. Minimere hvor lang tid oppvasken er ute av inkubatoren er avgjørende for å opprettholde embryohelse.Etter å ha fullført denne prosedyren, kan forskerne bruke isolerte enkeltceller for nedstrøms encellede omics-analyser, for eksempel encellede RNA-sekvensering og hele genombisulfittsekvensering for å bedre forstå epigenetiske og transkripsjonsmiiske endringer under menneskelig implantasjon og tidlig placentadannelse.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Menneskelige Somatiske celler i Utførte pluripotent stamceller (iPSCs) Bruke retrovirale Vector med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...