Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Gostaríamos de reconhecer os muitos pacientes do Centro de Medicina Reprodutiva do Colorado (CCRM) que graciosamente doaram seus embriões para pesquisa. Também gostaríamos de agradecer a Karen Maruniak e ao laboratório clínico da CCRM por sua ajuda no processamento de amostras de hCG, bem como Sue McCormick e sua equipe clínica de embriologia de FIV na CCRM por sua ajuda na coleta, armazenamento, rastreamento e doação de embriões. O financiamento foi fornecido internamente pela CCRM.

Todos os embriões humanos foram doados com consentimento para uso em pesquisa. Os protocolos para a cultura estendida do embrião humano foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional ocidental (estudo nº 1179872) e seguem diretrizes internacionais. Qualquer uso de embriões humanos deve ser revisto pelos órgãos de ética e governo adequados associados à instituição de pesquisa por meio deste protocolo.
1. Preparação
<ol><li>Prepare a mídia e as placas de recuperação um ...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

O desenvolvimento do protocolo para cultivar embriões humanos através da implantação permitiu aos cientistas explorar um tempo anteriormente inexplorado no desenvolvimento8,,9. Aqui, usamos um sistema de cultura estendido para cultivar embriões humanos e estudar a diferenciação do trophoblasto precoce antes da formação de placenta villous. Os métodos aqui descritos permitem coletar diferentes sublineagens de TB para uso na análise de células únicas a...

A implantação humana e o surgimento da placenta precoce são historicamente difíceis de investigar e permanecem em grande parte desconhecidos porque os tecidos humanos são inacessíveis nesta fase em que a gravidez é clinicamente indetectável. Modelos animais são inadequados, pois a placenta humana tem suas próprias características únicas em comparação com outros mamíferos euterianos. Por exemplo, a placenta humana invade profundamente a decidua com algumas células trophoblastas atingindo pelo menos o terço interno do miométrio uterino, enquanto outras células remodelam as artérias espiral uterinas. Mesmo nossos ancestrais evolutivos mais próximos, os primatas não humanos, mostram diferenças na morfologia placentária e interações trophoblastos com os tecidos deciduais maternos1,,2,3. A obtenção de embriões humanos pré-implantação in vitro não era possível até a década de 1980, quando a fertilização in vitro humana clínica (FIV) começou como uma prática de rotina para o tratamento da infertilidade4. Agora, blastocistos humanos podem ser cultivados in vitro para permitir a seleção de embriões mais viáveis para transferência, bem como permitir testes genéticos seguros. A melhoria das técnicas de cultura de embriões, bem como o uso crescente de FIV, produziram muitos blastocistos excedentes que permanecem após a conclusão dos ciclos de tratamento do paciente. Com o consentimento do paciente, aprovação do IRB e com certas restrições, esses blastocistos podem ser utilizados para estudos de pesquisa. Tornaram-se um recurso inestimável que foi utilizado para a derivação de células-tronco embrionárias humanas5, entendendo a transição da massa celular interna para células-tronco embrionárias6,,7e, mais recentemente, foram cultivadas com sucesso até o dia (D) 13 para remodelar a implantação humana8,,9. Ao utilizar abordagens de omics unicelulares recém-desenvolvidas, o acesso a esses tecidos embriões humanos em estágio de implantação tem oferecido oportunidades únicas para descrever os mecanismos moleculares que regulam esse processo de diferenciação celular altamente dinâmico, que antes eram impossíveis de explorar10,,11,,12,13.
Aqui, descrevemos os métodos utilizados em nossa recente publicação caracterizando a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante a implantação humana12. Este protocolo inclui o aquecimento de blastocistos vitrificados, cultura de embriões estendida até D12 pós FIV, digestão enzimática do embrião em células únicas e coleta de células para ensaios a jusante(Figura 1). Este sistema de cultura estendida apoia o desenvolvimento de embriões humanos em estágio de peri-implantação sem insumo materno e recapitula a diferenciação do trophoblasto que parece consistente com as observações feitas a partir de espécimes histológicos há muitos anos14,,15,,16,17. Durante a implantação, a população de trophoblasto é composta por pelo menos dois tipos de células: o citotrofoblasto progenitor mononucleado (CTB) e o sintiotrofost (STB) internucleado, diferenciado terminalmente diferenciado. Após a digestão da trippsina, o CTB são células pequenas e redondas que são morfologicamente indistinguíveis de outras linhagens celulares(Figura 2A, painel esquerdo). A separação do CTB de outras linhagens celulares, como epiblasto e endoderme primitivo, pode ser alcançada por seus distintos perfis transcriômicos revelados pelo sequenciamento de RNA de célula única. As células sincitotrofoblastos podem ser facilmente identificadas como estruturas de forma irregular que são significativamente maiores que os outros tipos de células e localizadas principalmente na periferia do embrião (Figura 2A, painel médio; Figura 2B, painel esquerdo). As células de trophoblasto migratório (MTB) são outra sublineagem trophoblasto encontrada durante a cultura estendida do embrião e podem ser reconhecidas como aparentemente se afastando do corpo principal do embrião (Figura 2A, painel direito, Figura 2B, painel direito). O trophoblasto migratório, embora expresse muitos dos mesmos marcadores do trophoblasto extra villous (EVT), não deve ser referido como EVT, uma vez que as estruturas villous na placenta não surgiram neste estágio inicial de desenvolvimento.
Experimentalmente, conseguimos coletar pequenos CTB e STB grandes que são facilmente distinguíveis depois que embriões são digeridos em células únicas em D8, D10 e D12 (Figura 2A,B). Os trophoblastos migratórios surgem nos estágios posteriores da cultura de embriões estendidos e podem ser coletados em D12 antes da digestão enzimática de todo o embrião (Figura 2A,B). Ao separar fenotipicamente essas três sublineagens trophoblastos antes da análise de células únicas, podemos identificar marcadores transcriômicos específicos e definir o papel biológico de cada tipo de célula. O citotrofoblasto é altamente proliferativo e atua como células progenitoras no fornecimento das linhagens diferenciadas STB e MTB10,,11,,12,,13. O sinintismotrofã está envolvido na produção de hormônios placentários para manter a gravidez e também pode ser responsável pelos embriões que penetram no endométrio10,,11,12,13. O trophoblasto migratório tem características ainda mais fortes de um fenótipo migratório invasivo e migratório e são provavelmente responsáveis pela colonização mais profunda e extensa do endométrio uterino10,,11,,12,13. Após a definição da assinatura transcriômica de cada tipo de célula, as análises de agrupamento também revelaram dois subconjuntos adicionais de células que eram morfologicamente indistinguíveis da CTB e tinham transcriptomes com características de STB e MTB,respectivamente 12. Essas células de estágio intermediário provavelmente estão no processo de diferenciação do CTB para as sublineagens MTB ou STB e teriam sido negligenciadas se os embriões fossem digeridos cegamente e as células fossem separadas apenas por transcriptome.
O protocolo descrito aqui utiliza um sistema de cultura bidimensional (2D) e pode não ser ideal para suportar o desenvolvimento estrutural tridimensional (3D), como sugerido por uma publicação recente descrevendo um recém-desenvolvido sistema de cultura 3D13. No entanto, neste sistema 2D a diferenciação do trophoblast precoce parece ser consistente com observações feitas a partir de espécimes in vivo14,,15,,16,17. Este protocolo também pode ser facilmente adaptado para o uso no recém-descrito sistema de cultura 3D13 com mudanças mínimas. Todas as etapas são realizadas com uma pipeta de micromanipulação portátil com pontas descartáveis comercialmente disponíveis ou uma pipeta bucal de uma pipeta de vidro finamente puxada presa a tubos de borracha, um filtro e um porta-voz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

A implantação humana, a apposição e a adesão à epitélia da superfície uterina e a subsequente invasão do blastocisto na decidua materna, é um evento biológico crítico, mas enigmático, historicamente difícil de estudar devido a limitações técnicas e éticas. A implantação é iniciada pelo desenvolvimento do trophectoderm ao trophoblasto e posterior diferenciação em sublineagens trophoblastos distintas. A diferenciação do trophoblasto precoce aberrante pode levar à falha de implantação, patologias placentárias, anormalidades fetais e aborto. Recentemente, foram desenvolvidos métodos para permitir que embriões humanos cresçam até o dia 13 pós-fertilização in vitro na ausência de tecidos maternos, período de tempo que abrange o período de implantação em humanos. Isso deu aos pesquisadores a oportunidade de investigar a implantação humana e recapitular a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante esse período crítico sem confundir influências maternas e evitar obstáculos inerentes ao estudo de eventos de diferenciação de embriões precoces in vivo. Para caracterizar diferentes sublinemas trophoblastos durante a implantação, adotamos métodos de cultura estendidos bidimensionais (2D) existentes e desenvolvemos um procedimento para digerir esnzimaticamente e isolar diferentes tipos de células trophoblastos para ensaios a jusante. Embriões cultivados em condições 2D têm uma morfologia relativamente achatada e podem ser subótimos na modelagem in vivo tridimensionais (3D) arquiteturas embrionárias. No entanto, a diferenciação do trophoblasto parece ser menos afetada, como demonstrado pela morfologia antecipada e mudanças na expressão genética ao longo da cultura estendida. Diferentes sublineagens trophoblastos, incluindo citotrofoblasto, sinintólogo e trophoblasto migratório podem ser separadas por tamanho, localização e emergência temporal, e usadas para caracterização ou experimentação. A investigação dessas células trophoblastos precoces pode ser fundamental na compreensão da implantação humana, no tratamento de patologias placentárias comuns e na mitigação da incidência de perda de gravidez.

Embriões saudáveis apresentaram proliferação contínua ao longo da cultura estendida(Figura 2B). Embriões anormais começaram a se retrair de suas bordas externas e se desintegrarem(Figura 2C). Pela nossa experiência, aproximadamente 75% dos embriões foram anexados ao fundo do prato revestido de fibronectina a 48 h e o acessório aumentou para aproximadamente 90% em 72 h na cultura. O sucesso do apego ao embrião pode ser em grande parte impactado pela qu...

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Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Muitas gestações falham no desenvolvimento de embriões humanos em torno dos sete ou oito pós-fertilização. Este protocolo oferece oportunidades aos investigadores para cultivar conceitos humanos in vitro durante esta misteriosa janela de implantação. Isso nos permite compreender os mecanismos que sustentam o sucesso da implantação humana e da formação placentária precoce.Usar um sistema de cultura estendido para cultivar embriões humanos em estágio de peri-implantação in vitro é provavelmente a única maneira de obter materiais autênticos para estudar a implantação e a diferenciação do trophoblasto precoce. Esta técnica simples é uma ferramenta poderosa que nos permite responder muitas perguntas fundamentais sobre o desenvolvimento precoce humano. Pesquisas realizadas com o uso deste protocolo contribuirão em grande parte para a compreensão da perda precoce da gravidez, da falha recorrente da implantação e das patologias da placenta.Demonstrando o procedimento estará Deirdre Logsdon, a doutoranda de um laboratório. Um dia antes do aquecimento do embrião, preparem a mídia e as placas de recuperação em um capô de fluxo laminar estéril. Encha dois pratos de lavagem de cultura de órgãos do centro com 500 microliters de BM com 10% SPS, depois cubra o BM com 500 microliters de óleo de grau de cultura de embriões.Em um prato de cultura de tecido de 16 milímetros, a camada oito mililitros de óleo de cultura de embriões e ancora 20 gotas de microliter de BM com 10% SPS para o fundo. Equilibre os pratos de lavagem e a placa de recuperação em uma incubadora a 37 graus Celsius, 6% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio por pelo menos quatro horas. Aliquot aproximadamente quatro mililitros de IVC 1 em um tubo de tampa de snap de cinco mililitros e prepare um prato de lavagem com 500 microliters de IVC 1 sem sobreposição de óleo.Equilibre o prato e o tubo na incubadora por pelo menos quatro horas. Fibronectina diluída do soro humano em PBS para 30 microgramas por mililitro. Abra o pacote de tampas bem câmara, tomando cuidado para não tocar nos poços, em seguida, delicadamente pipeta 250 microliters da fibronectina em cada poço.Substitua a tampa da tampa e incuba-a a quatro graus Celsius por 20 a 24 horas. Prepare a placa de cultura estendida na manhã do aquecimento do embrião. Recupere o deslizamento de cobertura com fibronectina e coloque-o na capa de fluxo laminar.Em seguida, remova a mistura de fibronectina com uma pipeta de um mililitro e descarte-a. Pipeta 300 microliters do IVC equilibrado 1 em cada poço e coloque o deslizamento na incubadora até a remoção da zona pellucida. Após o aquecimento e recuperação dos embriões humanos D5, avalie-os para a reesqueso e tire fotos de cada embrião.Mova cada embrião para 500 microliters de um meio de manuseio tamponado MOPS com 5% de FCS. Em seguida, trate-o com a solução ácida de Tyrode, conforme descrito no manuscrito do texto. Mova imediatamente o embrião com a zona dissolução em 300 microliters de meio tamponado MOPS aquecido para saciar a solução do Tyrode.Em seguida, mova o embrião para um prato de tecido de órgão de poço central contendo o BM equilibrado com 10% sps sob o óleo de grau de cultura embrião. Em seguida, devolva o embrião para a queda de recuperação de 20 microliter. Mova individualmente os embriões para o prato de lavagem com a mídia de IVC 1 equilibrada, em seguida, mova cuidadosamente cada embrião para um poço do deslizamento de cobertura câmara, certificando-se de acompanhar a identificação do embrião.Devolva a tampa de câmara para uma incubadora fixada a 37 graus Celsius, 6% de dióxido de carbono e oxigênio atmosférico por dois dias. No segundo dia de crescimento, examine cuidadosamente a fixação dos embriões sob o microscópio e troque a mídia. Saiba qual embrião está preso ao prato batendo suavemente na placa.Para alterar a mídia, remova a tampa e aspire cuidadosamente 150 microliters de IVC 1, tomando cuidado para não perturbar o embrião anexado. Se um embrião ainda não tiver ligado à placa, não troque a mídia porque o soro no IVC 1 ajudará na fixação. Pipeta lentamente 150 microliters de mídia de cultura estendida equilibrada, IVC 2 em cada poço e Substitua a tampa na tampa.Devolveu cuidadosamente o deslizamento de cobertura câmara para a incubadora. Repita a troca de mídia e verifique o anexo todos os dias até que os embriões estejam prontos para fixação ou digestão celular única. Se a coleta de mídia gasta for necessária para análise suplementar, congele os 150 microliters do IVC removido 1 em um tubo estéril de baixa ligação de 0,5 mililitro.Lave cada embrião uma vez com 200 microliters de PBS, depois adicione 200 microliters de solução de trippsina a cada poço. Devolva a tampa de câmara para a incubadora por cinco minutos. Use uma pipeta pequena ou uma pipeta bucal finamente puxada para pegar um MTB individual e, em seguida, use uma pipeta maior para dissociar suavemente o embrião aspirando para cima e para baixo.Continue aspirando o embrião suavemente e repetidamente usando uma ponta de pipeta de diâmetro menor até que o embrião tenha sido incubado por um total de 10 minutos em trippsina. Para realizar a seleção celular única, mova as células dissociadas através de 320 gotas de lavagem de microliter de PBS e 0,1% PVP sob óleo de cultura de embriões, tomando cuidado para não perder nenhuma célula. Depois de lavar as células use uma pipeta de vidro finamente puxada para selecionar uma célula.Pipete cuidadosamente a célula única em um tubo de ligação baixa de 0,2 mililitro estéril com um volume mínimo de PBS e PVP. Encaixe células únicas livres em nitrogênio líquido e armazene-as a 80 graus Celsius negativos para uso posterior. Embriões saudáveis apresentaram proliferação contínua ao longo da cultura estendida, enquanto embriões anormais começaram a se retrair de suas bordas externas e se desintegrar.No oitavo dia de fertilização pós-fertilização, a maioria das células nos embriões eram citotrofoblastos ou CTBs, que foram positivos para o marcador gata-3. Na periferia do embrião, os CTBs já estavam se diferenciando em sincitotrofoblastos multinucleados, que tinham uma folha como aparência e manchada positiva para humanos CGB. No dia 10, a formação de células trophoblastos migratórios positivos CGB estava no máximo, o que foi confirmado pelo aumento da produção de HCG na época.Os trophoblastos migratórios que mancharam positivo para o HLA-G, também começaram a emergir e migrar para longe do corpo embrionário. No dia 12, a diferenciação do STB estava em declínio e a produção de MTB tornou-se mais proeminente, sugerindo uma mudança de ênfase da produção hormonal no dia 10 para a migração celular no dia 12. Essas alterações podem ser observadas em um vídeo de lapso de tempo do período de peri-implantação.O vídeo demonstra o colapso da blastocele, a formação do STB e a eventual diferenciação e migração do MTB. A coisa mais importante a ter em mente ao completar este procedimento é que você está trabalhando com embriões vivos que são sensíveis a mudanças de temperatura, osmolalidade e pH. Minimizar o tempo que os pratos estão fora da incubadora é fundamental para manter a saúde dos embriões.Após a conclusão deste procedimento, os pesquisadores podem usar células únicas isoladas para ensaios de omics de células únicas a jusante, como sequenciamento de RNA de células únicas e sequenciamento de bisulfato de genoma inteiro para entender melhor as alterações epigenéticas e transcriômicas durante a implantação humana e a formação precoce da placenta.

Research

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Biology

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