Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Мы хотели бы отметить многих пациентов в Колорадо Центр репродуктивной медицины (CCRM), которые любезно пожертвовал свои эмбрионы для исследований. Мы также хотели бы поблагодарить Карен Маруняк и клиническую лабораторию CCRM за помощь в обработке образцов ХГЧ, а также Сью Маккормик и ее клиническую команду эмбриологии ЭКО в CCRM за помощь в сборе, хранении, отслеживании и донорстве эмбрионов. Финансирование было предоставлено внутри ККРМ.

Все человеческие эмбрионы были пожертвованы с согласия на использование в исследованиях. Протоколы о расширенной культуре эмбрионов человека были одобрены Западным институциональным советом по обзору (исследование No 1179872) и следуют международным руководящим принципам. Любое использ...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

Разработка протокола к культуре человеческих эмбрионов с помощью имплантации позволила ученым исследовать ранее неизведанное время вразработке 8,,9. Здесь мы используем расширенную культурную систему для культуры человеческих эмбрионов и изучаем ранн?...

Имплантация человека и появление ранней плаценты исторически трудно исследовать и остаются в значительной степени неизвестными, потому что человеческие ткани недоступны на данном этапе, когда беременность клинически не обнаруживается. Модели животных являются неадекватными, так как плацентация человека имеет свои уникальные особенности по сравнению с другими эвтерианскими млекопитающими. Например, человеческая плацента вторгается глубоко в decidua с некоторыми клетками trophoblast достижения по крайней мере внутренняя треть миометрия матки в то время как другие клетки реконструировать маточных спиральных артерий. Даже наши ближайшие эволюционные предки, не-человеческие приматы, показывают различия в плацентарный морфологии и трофибласт взаимодействия с материнскойрешающих тканей 1,2,3. Получение предварительной имплантации человеческих эмбрионов в пробирке было невозможно до 1980-х годов, когда клиническое оплодотворение человека в пробирке (ЭКО) началось как обычная практика длялечения бесплодия 4. Теперь, человеческие бластоцисты могут быть выращены в пробирке, чтобы обеспечить выбор более жизнеспособных эмбрионов для передачи, а также позволяют безопасное генетическое тестирование. Улучшение методов культуры эмбрионов, а также все более все более использование ЭКО дали много излишков бластоцист, который остается после цикла лечения пациента были завершены. С согласия пациента, IRB утверждения, и с определенными ограничениями, эти бластоцисты могут быть использованы для научных исследований. Они стали бесценным ресурсом, которые были использованы для получения человеческих эмбриональныхстволовых клеток 5,понимая переход внутренней клеточной массы к эмбриональным стволовым клеткам6,,7, а в последнее время, были успешно культурны до дня (D) 13для реконструкции человеческой имплантации 8,9. Используя недавно разработанные подходы одноклеточной омики, доступ к этой стадии имплантации тканей эмбриона человека предоставил уникальную возможность описать молекулярные механизмы, которые регулируют этот высокодинамительный процесс дифференциации клеток, которые ранеебыло невозможно исследовать 10,,11,12,13.
Здесь мы описываем методы, используемые в нашей недавней публикации, характеризующие динамику дифференциации трофибласта во время имплантациичеловека 12. Этот протокол включает в себя потепление vitrified бластоцисты, расширенный эмбрион культуры до D12 после ЭКО, энзиматическое переваривание эмбриона в одиночные клетки, и сбор клеток для вниз по течению анализы (Рисунок 1). Эта расширенная система культуры поддерживает пери-имплантации стадии развития эмбриона человека без материнского вклада и recapitulates трофибласт дифференциации, которая появляется в соответствии с наблюдениями, сделанными из гистологических образцовмного лет назад 14,15,16,17. Во время имплантации популяция трофибластов состоит как минимум из двух типов клеток: мононуклеастного прародителя типа цитотрофобласта (КТБ) и неизлечимо дифференцированного, многонуклеированного синцитиотрофобласта (СТБ). После пищеварения трипсина, CTB являются небольшими, круглые клетки, которые морфологически неотличимы от других клеточных линий(рисунок 2A, левая панель). Отделение CTB от других клеточных линий, таких как эпибласт и примитивный эндодерм, может быть достигнуто с помощью их различных транскриптомных профилей, выявленных одноклеточной РНК-секвенированием. Синцитиотрофобластные клетки могут быть легко идентифицированы как нерегулярные формы структур, которые значительно больше, чем другие типы клеток и в основном расположены на периферии эмбриона(рисунок 2A, средняя панель; Рисунок 2B, левая панель). Мигрирующие трофибластные клетки (МТБ) являются еще одним подлинием трофибласта, найденным во время расширенной культуры эмбриона, и могут быть признаны, казалось бы, отохаальными от основного тела эмбриона(рисунок 2A, правая панель, рисунок 2B, правая панель). Мигрирующая трофобласть, хотя и выражает многие из тех же маркеров, что и экстра-villous trophoblast (EVT), не следует называть EVT, так как поколенческие структуры в плаценте не появились на этой очень ранней стадии развития.
Экспериментально мы смогли собрать небольшие КТБ и большие СТБ, которые легко различимы после того, как эмбрионы перевариваются в одиночные клетки на D8, D10 и D12(рисунок 2A,B). Мигрирующие трофибласты возникают на более поздних стадиях расширенной культуры эмбриона и могут быть собраны в D12 до энзиматического пищеварения всего эмбриона(рисунок 2A,B). Фенотипически отделяя эти три подлинии трофибласта до анализа одноклеточных клеток, мы можем определить конкретные транскриптомные маркеры и определить биологическую роль каждого типа клеток. Цитотрофобласт являются высоко пролиферативными и выступать в качестве прародителя клеток в поставке СТБ иМТБ дифференцированных линий 10,11,12,13. Syncytiotrophoblast участвуют в производстве плацентарный гормонов для поддержания беременности, а также может быть ответственным за эмбрионы рытьсяв эндометрия 10,11,12,13. Мигрирующая трофибласт имеет еще более сильные особенности инвазивного, миграционного фенотипа и, вероятно, отвечает за более глубокую и обширную колонизациюэндометрия матки 10,,11,,12,,13. После определения транскриптомной подписи каждого типа клеток, кластеризации анализы также выявили два дополнительных подмножества клеток, которые были морфологически неотличимы от CTB и транскриптомы с особенностями STB и MTB, соответственно12. Эти промежуточные клетки стадии, вероятно, в процессе дифференциации от CTB либо MTB или STB подлинажей и были бы упущены, если эмбрионы были слепо усваивается и клетки были разделены транскриптома в одиночку.
Протокол, описанный здесь, использует двухмерную (2D) культурную систему и не может быть оптимальным для поддержки трехмерного (3D) структурного развития, как это было предложено в недавней публикации, описывающей недавно разработанную систему 3Dкультуры 13. Тем не менее, в этой 2D системе дифференциация раннего трофибласта, кажется, согласуется с наблюдениями, сделанными из образцов in vivo14,,15,,16,,17. Этот протокол также может быть легко адаптирован для использования в недавно описанной системе 3D культуры13 с минимальными изменениями. Все шаги выполняются с помощью портативной микроманипуляционной пипетки с коммерчески доступными одноразовыми наконечниками или ротовой пипеткой из тонко вытянутой стеклянной пипетки, прикрепленной к резиновым трубам, фильтру и мундштуку.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

Имплантация человека, аппозиция и прилипание к эпителии поверхности матки и последующее вторжение бластоцист в материнское решение, является критическим, но загадочным биологическим событием, которое исторически было трудно изучить из-за технических и этических ограничений. Имплантация инициируется развитием трофикодерма до раннейтрофобласти и последующей дифференциацией в отдельные подлины трофибластов. Аномальная ранняя дифференциация трофибластов может привести к отказу имплантации, плацентарным патологиям, аномалиям плода и выкидышу. В последнее время были разработаны методы, позволяющие человеческим эмбрионам расти до 13-го дня после оплодотворения в пробирке в отсутствие материнских тканей, период времени, который охватывает период имплантации у человека. Это дало исследователям возможность исследовать имплантацию человека и резюмировать динамику дифференциации трофибластов в этот критический период, не путая материнские влияния и избегая присущих препятствий для изучения событий ранней дифференциации эмбрионов in vivo. Для характеристики различных подлинаций трофобласти во время имплантации мы приняли существующие двухмерные (2D) расширенные методы культуры и разработали процедуру для энзиматичного переваривания и изоляции различных типов трофибластных клеток для анализа ниже по течению. Эмбрионы, выучатые в 2D условиях, имеют относительно сплющенную морфологию и могут быть неоптимальными при моделировании трехмерных (3D) эмбриональных архитектур in vivo. Тем не менее, трофибласт дифференциации, как представляется, менее пострадавших, о чем свидетельствуют ожидаемые морфологии и экспрессии генов изменения в течение расширенной культуры. Различные подлины трофобласта, включая цитотрофобласт, синцитиотрофобласт и миграционную трофибласт, могут быть разделены по размеру, местоположению и временному появлению и использованы для дальнейшей характеристики или экспериментов. Исследование этих ранних клеток трофибласта может быть полезным в понимании имплантации человека, лечении общих плацентарных патологий и смягчении частоты потери беременности.

Здоровые эмбрионы продемонстрировали продолжающееся распространение в течение расширенной культуры(рисунок 2B). Аномальные эмбрионы начали оттягиваться от внешних краев и распадаться(рисунок 2C). Из нашего опыта, около 75% эмбрионов были прикреплены к ни?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Здесь мы описываем метод нагрева витроцистов человека, культивируя их через период имплантации в пробирке, переваривая их в одиночные клетки и собирая ранние клетки трофибласта для дальнейшего исследования.

Одноклеточная коллекция трофибластных клеток в пери-имплантации этапе человеческих эмбрионов

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Многие беременности терпят неудачу на ранних стадиях развития эмбрионов человека в течение семи или восьми после оплодотворения. Этот протокол предоставляет возможность следователям выращивать человеческих концептуаров в пробирке во время этого таинственного окна имплантации. Это позволяет нам понять механизмы, которые лежат в основе успеха имплантации человека и раннего плацентарного образования.Использование расширенной системы культуры для выращивания пери-имплантации стадии человеческих эмбрионов in vitro, вероятно, единственный способ получить подлинные материалы для изучения имплантации и ранней дифференциации трофибласта. Этот простой метод является мощным инструментом, который позволяет нам ответить на многие фундаментальные вопросы о раннем развитии человека. Исследования, проведенные с использованием этого протокола, в значительной степени будут способствовать пониманию ранней потери беременности, рецидивирующей неудачи имплантации и патологий плаценты.Демонстрацией процедуры будет Deirdre Logsdon, аспирант из лаборатории. За день до потепления эмбриона, подготовить средства массовой информации и восстановления пластин в стерильной ламинарный капюшон потока. Заполните два центра хорошо орган культуры мыть посуду с 500 микролитров БМ с 10%SPS, а затем покрыть БМ с 500 микролитров эмбриона культуры класса нефти.В 16-миллиметровой ткани культуры блюдо, слой восемь миллилитров эмбриона культуры нефти и якорь 20 микролитровых капель БМ с 10%SPS на дно. Эквилибрировать мыть посуду и восстановление пластины в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию, 6%углекислого газа и 5%кислорода, по крайней мере четыре часа. Aliquot примерно четыре миллилитров IVC 1 в пять миллилитров оснастки крышка трубки и подготовить одну тарелку мыть с 500 микролитров IVC 1 без масла наложения.Эквилибрировать блюдо и трубку в инкубаторе, по крайней мере четыре часа. Разбавить фибронектин из человеческой сыворотки в PBS до 30 микрограмм на миллилитр. Откройте восемь хорошо камерных coverslip пакет заботясь, чтобы не прикасаться к скважинам, а затем осторожно пипетки 250 микролитров фибронектина в каждой скважине.Замените крышку на крышке и инкубировать его при четырех градусах по Цельсию в течение 20 до 24 часов. Подготовка расширенной пластины культуры на утро потепления эмбриона. Извлеките камерную крышку скольжения с фибронектином и поместите его в капот ламинарного потока.Затем удалите фибронектин смесь с одним миллилитров пипетки и выбросить его. Pipette 300 микролитров equilibrated IVC 1 в каждую колодец и поместите крышку в инкубатор до удаления zona pellucida. После потепления и восстановления человеческих эмбрионов D5, оценить их для повторного расширения и сфотографировать каждый эмбрион.Перемести каждый эмбрион на 500 микролитров буферной среды обработки MOPS с 5%FCS. Затем обработать его кислым раствором Тирода, как описано в рукописи текста. Немедленно переместите эмбрион с растворяемой зоной в 300 микролитров разогретой MOPS буферной среды, чтобы утолить раствор Тирода.Затем переместите эмбрион в центральную тарелку ткани органов, содержащую уравновешенный БМ с 10%SPS под маслом класса культуры эмбриона. Затем верните эмбрион к падению восстановления 20 микролитров. Индивидуально переместите эмбрионы в мытье тарелки с equilibrated IVC 1 средств массовой информации, а затем тщательно переместить каждый эмбрион в колодец камерной крышки, убедившись, что отслеживать идентификацию эмбриона.Верните камерный крышку в инкубатор, установленный до 37 градусов по Цельсию, 6%углекислого газа и атмосферного кислорода в течение двух дней. На второй день, внимательно изучить вложение эмбрионов под микроскопом и обмена средствами массовой информации. Знайте, какой эмбрион прилагается к блюду, осторожно нажав на тарелку.Чтобы изменить средства массовой информации, снимите крышку и тщательно аспирировать 150 микролитров IVC 1, заботясь, чтобы не беспокоить прикрепленный эмбрион. Если эмбрион еще не прикреплен к пластине, не обмениваться средствами массовой информации, потому что сыворотка в IVC 1 поможет в вложении. Медленно пипетки 150 микролитров equilibrated расширенной культуры средств массовой информации, IVC 2 в каждой хорошо и заменить крышку на обложке.Аккуратно вернули камерные крышки в инкубатор. Повторяйте обмен мультимедиа и проверку вложений каждый день, пока эмбрионы не будут готовы к фиксации или одноклеточному пищеварению. Если сбор оттраченных средств массовой информации необходим для дальнейшего анализа, заморозить 150 микролитров удаленных IVC 1 в стерильной низкой связывают 0,5 миллилитров трубки.Вымойте каждый эмбрион один раз с 200 микролитров PBS, а затем добавить 200 микролитров трипсина решение каждой хорошо. Верните камерную крышку в инкубатор на пять минут. Используйте небольшую пипетку или мелко вытащил рот пипетку, чтобы забрать отдельные MTB затем использовать большую пипетку, чтобы мягко разобщить эмбрион, аспирируя вверх и вниз.Продолжить аспирации эмбриона мягко и неоднократно с помощью меньшего диаметра пипетки отзыв, пока эмбрион был инкубирован в общей сложности 10 минут в трипсин. Для выполнения одного выбора клеток, переместить диссоциированные клетки через 320 микролитер мыть капли PBS и 0,1%PVP под эмбрион культуры нефти, заботясь, чтобы не потерять любые клетки. После мытья клетки используют мелко вытащил стеклянную пипетку, чтобы выбрать одну клетку.Тщательно пипетка одной клетки в стерильные 0,2 миллилитров низкой связывания трубки с минимальным объемом PBS и PVP. Прикрепте свободные одиночные клетки в жидком азоте и храните их на отрицательных 80 градусах Celsius для более дальнейшего использования. Здоровые эмбрионы проявляли продолжающееся распространение в течение расширенной культуры, в то время как ненормальные эмбрионы начали оттягиваться от внешних краев и распадаться.На восьмой день после оплодотворения большинство клеток эмбрионов были цитотрофобластом или КТБ, которые были положительными для трофибластного маркера GATA-3. На периферии эмбриона, CTBs уже дифференциации в многонуклеатических синцитотрофобластов, которые были лист, как внешний вид и окрашенных положительные для человека CGB. На 10-й день формирование положительной миграционной трофибластной клетки ЦБ было на максимуме, что было подтверждено всплеском производства ГХГ в это время.Мигрирующие трофибласты, которые окрашены положительным для HLA-G, также начали появляться и мигрировать от тела эмбриона. К 12-му дню дифференциация СТБ была в упадке, и производство МТБ стало более заметным, что свидетельствует о смене акцента с производства гормонов на 10-й день на миграцию клеток на 12-й день. Эти изменения можно наблюдать в замедленном видео пери-имплантации периода.Видео демонстрирует коллапс бластоцеле, образование СТБ, а также возможную дифференциацию и миграцию МТБ. Самое главное, что нужно иметь в виду при завершении этой процедуры является то, что вы работаете с живыми эмбрионами, которые чувствительны к изменениям температуры, осмолальности и рН. Минимизация количества времени, в течение которого блюда находятся вне инкубатора, имеет решающее значение для поддержания здоровья эмбриона.После завершения этой процедуры, исследователи могут использовать изолированные одиночные клетки для вниз по течению одноклеточных омиков анализы, такие как одноклеточная РНК секвенирования и всего генома бисульфита секвенирования, чтобы лучше понять эпигенетические и транскриптомные изменения во время имплантации человека и раннего образования плаценты.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Размещение фактор роста покрытием бисер на ранних эмбрионов куриного этап

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

В Ovo Electroporations Его Святейшества Стадия 10 эмбрионов куриного

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Вывод Мышь трофобласта стволовых клеток из бластоцист

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

Одноместный Трансфекция сотовый на куриных эмбрионах

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Хроматин Иммунопреципитация Пробирной для тканеспецифические Гены использованием ранней стадии эмбрионы мыши

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Изоляция первичной мышь клетки трофобласта и анализа трофобласта Вторжение

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Перепрограммирование соматических клеток человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) Использование ретровирусных вектор с GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...