Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
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Nos gustaría reconocer a los muchos pacientes del Centro de Medicina Reproductiva de Colorado (CCRM) que han donado amablemente sus embriones para la investigación. También queremos agradecer a Karen Maruniak y al laboratorio clínico de CCRM por su ayuda en el procesamiento de muestras de hCG, así como a Sue McCormick y su equipo clínico de embriología de FIV en CCRM por su ayuda con la recolección, almacenamiento, seguimiento y donación de embriones. La financiación fue proporcionada internamente por el CCRM.

Todos los embriones humanos han sido donados con consentimiento para su uso en la investigación. Los protocolos para el cultivo prolongado de embriones humanos han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional Occidental (estudio n.o 1179872) y siguen las directrices internacionales. Cualquier uso de embriones humanos debe ser revisado por los órganos de ética y de gobierno apropiados asociados con la institución de investigación que utilice este protocolo.
1. Preparación
<ol>...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

El desarrollo del protocolo para el cultivo de embriones humanos a través de la implantación ha permitido a los científicos explorar un tiempo previamente desconocido en el desarrollo8,,9. Aquí, utilizamos un sistema de cultivo extendido para cultivar embriones humanos y estudiar la diferenciación temprana de trofobos antes de la formación de placenta villosa. Los métodos descritos aquí nos permiten recopilar diferentes sublineaciones de TB para su uso en...

La implantación humana y la aparición de la placenta temprana son históricamente difíciles de investigar y permanecen en gran medida desconocidas porque los tejidos humanos son inaccesibles en esta etapa en la que el embarazo es clínicamente indetectable. Los modelos animales son inadecuados, ya que la placentación humana tiene sus propias características únicas en comparación con otros mamíferos euterianos. Por ejemplo, la placenta humana invade profundamente la decidua con algunas células trofoblastas que alcanzan al menos el tercio interno del miometrio uterino, mientras que otras células remodelan las arterias espirales uterinas. Incluso nuestros ancestros evolutivos más cercanos, los primates no humanos, muestran diferencias en la morfología placentaria y las interacciones trofoblastas con los tejidos deciduales maternos1,,2,,3. La obtención de embriones humanos preimplantacionales in vitro no fue posible hasta que en la década de 1980, cuando la fecundación in vitro humana clínica (FIV) comenzó como una práctica rutinaria para el tratamiento de la infertilidad4. Ahora, los blastocistos humanos se pueden cultivar in vitro para permitir la selección de embriones más viables para la transferencia, así como para permitir pruebas genéticas seguras. La mejora de las técnicas de cultivo de embriones, así como el uso cada vez mayor de la FIV ha producido muchos blastocistos excedentes que permanecen después de que se hayan completado los ciclos de tratamiento del paciente. Con el consentimiento del paciente, la aprobación del IRB, y con ciertas restricciones, estos blastocistos pueden ser utilizados para estudios de investigación. Se han convertido en un recurso invaluable que se utilizaron para la derivación de células madre embrionarias humanas5, la comprensión de la transición de la masa celular interna a las células madre embrionarias6,,7,y más recientemente, se han cultivado con éxito hasta el día (D) 13 para remodelar la implantación humana8,,9. Mediante la utilización de enfoques omics de células únicas desarrollados recientemente, el acceso a estos tejidos embrionarios humanos en etapas de implantación ha ofrecido oportunidades únicas para describir los mecanismos moleculares que regulan este proceso de diferenciación celular altamente dinámico, que antes eran imposibles de explorar10,,11,,12,,13.
Aquí, describimos los métodos utilizados en nuestra reciente publicación que caracteriza la dinámica de la diferenciación de trofoblastos durante la implantación humana12. Este protocolo incluye el calentamiento de blastocistos vitrificados, el cultivo de embriones extendido hasta D12 después de la FIV, la digestión enzimática del embrión en células individuales y la recolección celular para ensayos posteriores (Figura 1). Este sistema de cultivo extendido apoya el desarrollo embrionario humano en etapa periimplantacional sin aportes maternos y recapitula la diferenciación trofoblasta que parece coherente con las observaciones hechas de especímenes histológicos hace muchos años14,,15,,16,,17. Durante la implantación, la población de trofoblastos se compone de al menos dos tipos de células: el citotrofoblasto mononucleado similar a un progenitor (CTB) y el sintiotrofoboque multinucleado diferenciado terminalmente (STB). Tras la digestión de la trippsina, las CTB son células pequeñas y redondas que son morfológicamente indistinguibles de otros linajes celulares(Figura 2A,panel izquierdo). La separación de CTB de otros linajes celulares, como el epíblasto y el endodermo primitivo, se puede lograr mediante sus distintos perfiles transcriptómicos revelados por la secuenciación de ARN de una sola célula. Las células de sincitiotrofoblastos se pueden identificar fácilmente como estructuras de forma irregular que son significativamente más grandes que los otros tipos de células y se encuentran principalmente en la periferia del embrión (Figura 2A,panel medio; Figura 2B, panel izquierdo). Las células trofoblastas migratorias (MTB) son otro sublineaje trofoblasto encontrado durante el cultivo extendido embrionario y pueden reconocerse como aparentemente alejarse del cuerpo principal del embrión(Figura 2A,panel derecho, Figura 2B,panel derecho). El trofoblasto migratorio, aunque expresa muchos de los mismos marcadores que el trofoblasto villoso extra (EVT), no debe denominarse EVT, ya que las estructuras villosas de la placenta no han surgido en esta etapa muy temprana de desarrollo.
Experimentalmente, pudimos recoger pequeños CTB y STB grandes que son fácilmente distinguibles después de que los embriones se digieren en células individuales en D8, D10 y D12(Figura 2A,B). Los trofoblastos migratorios surgen en las etapas posteriores del cultivo embrionario prolongado y se pueden recoger en D12 antes de la digestión enzimática de todo el embrión (Figura 2A,B). Al separar fenotípicamente estos tres sublines trofoblastos antes del análisis de una sola célula, podemos identificar marcadores transcriptómicos específicos y definir el papel biológico de cada tipo de célula. Citotrofoblast son altamente proliferativos y actúan como células progenitoras en el suministro de los linajes diferenciados STB y MTB10,,11,12,,13. Syncytiotrophoblast está implicado en la producción de hormonas placentarias para mantener el embarazo y también puede ser responsable de los embriones que se entierran en el endometrio10,11,12,13. El trofoblasto migratorio tiene características aún más fuertes de un fenotipo invasor, migratorio y es probable que sea responsable de una colonización más profunda y extensa del endometrio uterino10,,11,,12,,13. Después de definir la firma transcriptómica de cada tipo de célula, los análisis de agrupación en clústeres también han revelado dos subconjuntos adicionales de células que eran morfológicamente indistinguibles de CTB y tenían transcriptomas con características de STB y MTB, respectivamente12. Es probable que estas células de estadio intermedio se dilecen de CTB a los sublineages MTB o STB y se habrían pasado por alto si los embriones se digieren ciegamente y las células estuvieran separadas por transcriptoma solo.
El protocolo descrito aquí utiliza un sistema de cultivo bidimensional (2D) y puede no ser óptimo para apoyar el desarrollo estructural tridimensional (3D), como sugiere una publicación reciente que describe un sistema de cultivo 3D recién desarrollado13. Sin embargo, en este sistema 2D la diferenciación del trofoblasto temprano parece ser consistente con las observaciones hechas de especímenes in vivo14,,15,,16,,17. Este protocolo también se puede adaptar fácilmente para su uso en el sistema de cultivo 3D13 recientemente descrito con cambios mínimos. Todos los pasos se llevan a cabo con una pipeta de micromanipulación de mano con puntas desechables disponibles comercialmente o una pipeta de boca de una pipeta de vidrio finamente tirada unida a tubos de goma, un filtro y una boquilla.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

La implantación humana, la aposición y adhesión a la epitelia superficial uterina y la posterior invasión del blastocisto en la decidua materna, es un evento biológico crítico pero enigmático que ha sido históricamente difícil de estudiar debido a limitaciones técnicas y éticas. La implantación se inicia mediante el desarrollo del trofctodermo al trofoblasto temprano y la posterior diferenciación en sublineaciones de trofoblastos distintos. La diferenciación aberrante temprana de trofoboblastos puede conducir a insuficiencia de implantación, patologías placentarias, anomalías fetales y aborto espontáneo. Recientemente, se han desarrollado métodos para permitir que los embriones humanos crezcan hasta el día 13 después de la fertilización in vitro en ausencia de tejidos maternos, un período de tiempo que abarca el período de implantación en humanos. Esto ha dado a los investigadores la oportunidad de investigar la implantación humana y recapitular la dinámica de la diferenciación de trofoblastos durante este período crítico sin confundir las influencias maternas y evitando obstáculos inherentes para estudiar los primeros eventos de diferenciación embrionaria in vivo. Para caracterizar diferentes sublines de trofoblastos durante la implantación, hemos adoptado métodos de cultivo extendidos bidimensionales (2D) existentes y desarrollado un procedimiento para digerir y aislar enzimáticamente diferentes tipos de células trofoblastas para ensayos posteriores. Los embriones cultivados en condiciones 2D tienen una morfología relativamente aplanada y pueden ser subóptales en el modelado de arquitecturas embrionarias tridimensionales in vivo (3D). Sin embargo, la diferenciación de trofoblastos parece verse menos afectada como lo demuestran los cambios previstos en la morfología y la expresión génica a lo largo de la cultura extendida. Diferentes sublineages de trofoblastos, incluyendo citotroblasto, sincitiotrofobia y trofoblasto migratorio pueden separarse por tamaño, ubicación y emergencia temporal, y utilizarse para una mayor caracterización o experimentación. La investigación de estas células trofoblastas tempranas puede ser fundamental para comprender la implantación humana, tratar patologías placentarias comunes y mitigar la incidencia de pérdida del embarazo.

Los embriones sanos mostraron proliferación continua a lo largo del cultivo extendido(Figura 2B). Los embriones anormales comenzaron a retraerse de sus bordes exteriores y desintegrarse (Figura 2C). Según nuestra experiencia, aproximadamente el 75% de los embriones se unieron a la parte inferior del plato recubierto de fibronectina a 48 h y el accesorio aumentó a aproximadamente el 90% en 72 h en cultivo. El éxito de la unión de embriones puede verse afecta...

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Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Aquí, describimos un método para calentar blastocistos humanos vitrificados, cultivarlos a través del período de implantación in vitro, digerirlos en células individuales y recoger las células trofoblastas tempranas para su posterior investigación.

Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Muchos embarazos fracasan al principio del desarrollo embrionario humano alrededor de los siete u ocho después de la fertilización. Este protocolo ofrece oportunidades a los investigadores para hacer crecer los conceptores humanos in vitro durante esta misteriosa ventana de implantación. Esto nos permite comprender los mecanismos que sustentan el éxito de la implantación humana y la formación temprana de la placenta.El uso de un sistema de cultivo extendido para cultivar embriones humanos en estadio periimplantación in vitro es probablemente la única manera de obtener materiales auténticos para estudiar la implantación y la diferenciación temprana de trofoblastos. Esta técnica sencilla es una poderosa herramienta que nos permite responder a muchas preguntas fundamentales sobre el desarrollo temprano humano. Las investigaciones realizadas con el uso de este protocolo contribuirán en gran medida a la comprensión de la pérdida temprana del embarazo, el fracaso recurrente de la implantación y las patologías de la placenta.Demostrando el procedimiento estará Deirdre Logsdon, el estudiante de doctorado de un laboratorio. Un día antes del calentamiento del embrión, prepare los medios y las placas de recuperación en una campana de flujo laminar estéril. Llenar dos platos de lavado de cultivo de órganos de pozo central con 500 microlitros de BM con 10%SPS, luego cubrir el BM con 500 microlitros de aceite de grado de cultivo embrionario.En un plato de cultivo de tejido de 16 milímetros, capa ocho mililitros de aceite de cultivo embrionario y anclaje 20 microlitro gotas de BM con 10%SPS hasta la parte inferior. Equilibre los platos de lavado y la placa de recuperación en una incubadora a 37 grados Celsius, 6% dióxido de carbono y 5% oxígeno durante al menos cuatro horas. Aliquot aproximadamente cuatro mililitros de IVC 1 en un tubo de tapa de presión de cinco mililitros y preparar un plato de lavado con 500 microlitros de IVC 1 sin recubrimiento de aceite.Equilibrar el plato y el tubo en la incubadora durante al menos cuatro horas. Diluir la fibronectina del suero humano en PBS a 30 microgramos por mililitro. Abra el paquete de cubreobjetos de ocho bien acobas teniendo cuidado de no tocar los pozos, luego pipetee suavemente 250 microlitros de la fibronectina en cada pozo.Vuelva a colocar la tapa en el cubreobjetos e incubarlo a cuatro grados centígrados durante 20 a 24 horas. Preparar la placa de cultivo extendida en la mañana del calentamiento del embrión. Recupere el resbalón de cubierta con cámara con fibronectina y colóquelo en la campana de flujo laminar.A continuación, retire la mezcla de fibronectina con una pipeta de un mililitro y deséchela. Pipetear 300 microlitros de la CIV 1 equilibrada en cada pozo y colocar el cubreobjetos en la incubadora hasta la eliminación de la zona pellucida. Después del calentamiento y la recuperación de los embriones humanos D5, evalúe su reaparión y tome fotografías de cada embrión.Mueva cada embrión a 500 microlitros de un medio de manipulación con búfer MOPS con 5%FCS. Luego trátalo con la solución ácida de Tyrode como se describe en el manuscrito de texto. Mueva inmediatamente el embrión con la zona de disolución en 300 microlitros de medio con búfer MOPS calentado para apagar la solución del Tyrode.A continuación, mueva el embrión a un plato de tejido de órgano de pozo central que contenga el BM equilibrado con 10%SPS bajo el aceite de grado de cultivo del embrión. A continuación, devuelva el embrión a la caída de recuperación de 20 microlitrotros. Mueva individualmente los embriones al plato de lavado con el medio IVC 1 equilibrado, luego mueva cuidadosamente cada embrión a un pozo del cubreobjetos con cámara, asegurándose de realizar un seguimiento de la identificación del embrión.Devuelva el cubreobjetos con cámara a una incubadora establecida en 37 grados Celsius, 6% dióxido de carbono y oxígeno atmosférico durante dos días. En el día dos, examine cuidadosamente la fijación de los embriones bajo el microscopio e intercambie los medios. Sepa qué embrión está unido al plato tocando suavemente el plato.Para cambiar el medio, retire la tapa y aspire cuidadosamente 150 microlitros de IVC 1, teniendo cuidado de no molestar al embrión conectado. Si un embrión aún no se ha unido a la placa, no cambie el medio porque el suero de la CIV 1 ayudará a la fijación. Pipeta lentamente 150 microlitros de medios de cultivo extendidos equilibrados, IVC 2 en cada pozo y Reemplazar la tapa en el cubreobjetos.Devolvió cuidadosamente el cubreobjetos con cámara a la incubadora. Repita el intercambio de medios y la verificación de fijación todos los días hasta que los embriones estén listos para la fijación o la digestión de una sola célula. Si la recolección de medios gastados es necesaria para un análisis posterior, congele los 150 microlitros de IVC 1 eliminado en un tubo estéril de unión baja de 0,5 mililitros.Lave cada embrión una vez con 200 microlitros de PBS, luego agregue 200 microlitros de solución de trippsina a cada pozo. Vuelva a colocar el cubreobjetos con cámara en la incubadora durante cinco minutos. Utilice una pipeta pequeña o una pipeta de boca finamente tirada para recoger un MTB individual y luego utilice una pipeta más grande para disociar suavemente el embrión aspirando hacia arriba y hacia abajo.Continúe aspirando el embrión suavemente y repetidamente usando una punta de pipeta de menor diámetro hasta que el embrión haya sido incubado durante un total de 10 minutos en tripina. Para realizar la selección de una sola célula, mueva las células disociadas a través de 320 gotas de lavado de microlitros de PBS y 0.1%PVP bajo aceite de cultivo embrionario, teniendo cuidado de no perder ninguna célula. Después de lavar las células utilice una pipeta de vidrio finamente tirada para seleccionar una celda.Pipetee cuidadosamente la célula única en un tubo de unión bajo estéril de 0,2 mililitros con un volumen mínimo de PBS y PVP. Enganche las células individuales libres en nitrógeno líquido y guárdelas en 80 grados Celsius negativos para su uso posterior. Los embriones sanos mostraron proliferación continua a lo largo del cultivo prolongado, mientras que los embriones anormales comenzaron a retraerse de sus bordes exteriores y desintegrarse.En el día ocho después de la fertilización, la mayoría de las células en los embriones eran citotrofobia o CTB, que eran positivas para el marcador de trofoblasto GATA-3. En la periferia del embrión, los CTB ya estaban diferenciando en sindiscotiostiotrofoblastos multinólidos, que tenían una hoja como apariencia y teñido positivo para los seres humanos CGB. En el día 10, la formación de células de trofoblasto migratorios positivas de CGB estaba en un máximo, lo que fue confirmado por el aumento de la producción de HCG en este momento.Los trofoblastos migratorios que manchan positivos para el HLA-G, también comenzaron a emerger y migrar lejos del cuerpo embrionario. Para el día 12, la diferenciación de STB estaba en declive y la producción de MTB se hizo más prominente, lo que sugiere un cambio de énfasis de la producción de hormonas en el día 10 a la migración celular el día 12. Estos cambios se pueden observar en un vídeo de lapso de tiempo del período periimplantación.El video muestra el colapso del blastocele, la formación del STB, y la eventual diferenciación y migración de MTB. Lo más importante a tener en cuenta al completar este procedimiento es que está trabajando con embriones vivos que son sensibles a los cambios de temperatura, osmolalidad y pH. Minimizar la cantidad de tiempo que los platos están fuera de la incubadora es fundamental para mantener la salud embrionaria.Después de completar este procedimiento, los investigadores pueden utilizar células individuales aisladas para ensayos de omica de células individuales aguas abajo, como la secuenciación de ARN de células simples y la secuenciación de bisulfito del genoma completo para comprender mejor los cambios epigenéticos y transcriptómicos durante la implantación humana y la formación temprana de placenta.

Research

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Biology

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