Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Vi vill erkänna de många patienter vid Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) som nådigt har donerat sina embryon för forskning. Vi vill också tacka Karen Maruniak och det kliniska laboratoriet på CCRM för deras hjälp med bearbetning av hCG-prover, samt Sue McCormick och hennes kliniska IVF embryologi team på CCRM för deras hjälp med embryosamling, lagring, spårning och donation. Finansieringen tillhandahölls internt av CCRM.

Alla mänskliga embryon har donerats med samtycke för användning i forskning. Protokoll för utökad mänsklig embryokultur har godkänts av Western Institutional Review Board (studie nr 1179872) och följer internationella riktlinjer. All användning av mänskliga embryon måste granskas av de lämpliga etiska och styrande organ som är knutna till forskningsinstitutionen med hjälp av detta protokoll.
1. Förberedelse
<ol><li>Förbered media och återhämtning plattor en dag före embryo...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

Utvecklingen av protokollet till kultur mänskliga embryon genom implantation har gjort det möjligt för forskare att utforska en tidigare outforskad tid i utveckling8,9. Här använder vi ett utökat odlingssystem för att odla mänskliga embryon och studera tidig trophoblast-differentiering före bildandet av villös moderkakan. De metoder som beskrivs här tillåter oss att samla in olika TB sublineages för användning i nedströms single-cell analys. Detta ...

Human implantation och uppkomsten av den tidiga moderkakan är historiskt svårt att undersöka och förblir till stor del okända eftersom mänskliga vävnader är otillgängliga i detta skede när graviditeten är kliniskt omöjlig att upptäcka. Djurmodeller är otillräckliga, eftersom människans placentation har sina egna unika egenskaper jämfört med andra eutherian däggdjur. Till exempel, mänskliga moderkakan invaderar djupt in i decidua med några trophoblast celler når åtminstone den inre tredjedelen av livmoderns myometrium medan andra celler remodel livmodern spiral artärer. Även våra närmaste evolutionära förfäder, de icke-mänskliga primater, visar skillnader i placenta morfologi och trofoblast interaktioner med moderns decidual vävnader1,2,3. Att få fram förimplantationen mänskliga embryon in vitro var inte möjligt förrän på 1980-talet då klinisk human in vitro-fertilisering (IVF) började som en rutinpraxis för behandling av infertilitet4. Nu kan mänskliga blastocysts odlas in vitro för att möjliggöra val av mer livskraftiga embryon för överföring, samt möjliggöra säker genetisk testning. Förbättring av embryokultur tekniker, liksom den ökande användningen av IVF har gett många överskott blastocysts som kvarstår efter patientens behandling cykler har slutförts. Med patientens samtycke, IRB-godkännande, och med vissa begränsningar, dessa blastocysts kan utnyttjas för forskningsstudier. De har blivit en ovärderlig resurs som användes för härledning av mänskliga embryonala stamceller5, förstå övergången av inre cellmassa till embryonala stamceller6,7, och på senare tid, har framgångsrikt odlade fram till dag (D) 13 till remodel mänsklig implantation8,9. Genom att utnyttja nyligen utvecklade single cell omics metoder, tillgång till dessa implantation skede mänskliga embryo vävnader har erbjudit unika möjligheter att beskriva de molekylära mekanismer som reglerar denna mycket dynamisk cell differentiering process, som tidigare var omöjligt attutforska 10,11,12,13.
Här beskriver vi de metoder som används i vår senaste publikation som kännetecknar dynamiken i trophoblast differentiering under människans implantation12. Detta protokoll omfattar uppvärmningen av förglasade blastocysts, utökad embryo kultur upp till D12 post IVF, enzymatisk matsmältning av embryot i enstaka celler, och cellsamling för nedströms analyser (Figur 1). Detta utökade kultur system stöder peri-implantation skede mänskliga embryot utveckling utan moderns input och rekapituler trophoblast differentiering som verkar överensstämma med de observationer som gjorts från histologiska exemplar många år sedan14,15,16,17. Under implantationen består trofoblastpopulationen av minst två celltyper: den mononuklerade progenitorliknande cytotrofoblast (CTB) och den terminalt differentierade, flerkärniga synkietiotrofoblast (STB). Vid trypsin matsmältningen, CTB är små, runda celler som är morfologiskt omöjlig att skilja från andra cell härstamningar (Figur 2A, vänster panel). Separation av CTB från andra cellinje, såsom epiblast och primitiva endoderm, kan uppnås genom deras distinkta transkriptomiska profiler avslöjas av enda cell RNA sekvensering. Syncytiotrophoblast celler kan lätt identifieras som oregelbundna formade strukturer som är betydligt större än de andra celltyperna och huvudsakligen ligger i periferin av embryot (Figur 2A, mellanpanelen; Bild 2B, vänster panel). Flyttande trofoblastceller (MTB) är en annan trophoblast sublineage som finns under embryo utökade kultur och kan erkännas som till synes flytta bort från huvuddelen av embryot (Figur 2A, höger panel, Figur 2B, höger panel). Flyttande trofoblast, även om de uttrycker många av samma markörer som extra villous trophoblast (EVT), bör inte kallas EVT, eftersom villous strukturerna i moderkakan inte har uppstått i detta mycket tidiga utvecklingsstadium.
Experimentellt kunde vi samla små CTB och stora STB som är lätt att skilja efter embryon rötas i enstaka celler på D8, D10, och D12 (Figur 2A,B). Flyttande trofoblaster uppstår i de senare stadierna av utökad embryokultur och kan samlas in vid D12 före enzymatisk rötning av hela embryot (Figur 2A,B). Genom att fenotypiskt separera dessa tre trofoblast dellinjer innan encellsanalys, kan vi identifiera specifika transkriptomic markörer och definiera den biologiska roll varje celltyp. Cytotrofoblast är mycket proliferativ och fungerar som stamceller i att leverera STB och MTB differentierade härstamningar10,11,12,13. Syncytiotrophoblast är involverade i att producera placentahormoner för att upprätthålla graviditet och kan också vara ansvarig för embryon som gräver i livmoderslemhinnan10,11,12,13. Flyttande trofoblast har ännu starkare drag av en invasiv, flyttande fenotyp och är sannolikt ansvarig för djupare och mer omfattande kolonisering av livmoderns livmoderenstrium10,11,12,13. Efter att ha definierat transkriptomiska signaturen för varje celltyp har klustringsanalyser också avslöjat två ytterligare undergrupper av celler som var morfologiskt omöjliga att skilja från CTB och hade transkriptomer med funktioner i STB och MTB, respektive12. Dessa mellanliggande steg celler är sannolikt i färd med att skilja från CTB till antingen MTB eller STB dellinjer och skulle ha förbisetts om embryon var blint smält och celler separerades av transkriptom ensam.
Protokollet som beskrivs här utnyttjar ett tvådimensionellt (2D) kultursystem och kanske inte är optimalt för att stödja tredimensionell (3D) strukturell utveckling, som föreslagits av en nyligen publicerad som beskriver en nyutvecklad 3D-kultur system13. Ändå, i detta 2D-system differentiering av tidig trophoblast verkar vara förenligt med observationer gjorda av in vivo exemplar14,15,16,17. Detta protokoll kan också lätt anpassas för användning i den nyligen beskrivna 3D-kultur system13 med minimala förändringar. Alla steg utförs med en handhållen mikromanipulationspipett med kommersiellt tillgängliga engångsspetsar eller en munpipett från en findragen glaspipett fäst vid gummislangar, ett filter, och ett munstycke.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

Mänskliga implantation, apposition och vidhäftning till livmoderns yta epithelia och efterföljande invasionen av blastocyst i moderns decidua, är en kritisk men gåtfulla biologiska händelse som har historiskt svårt att studera på grund av tekniska och etiska begränsningar. Implantation initieras av utvecklingen av trophectoderm till tidig trophoblast och efterföljande differentiering till distinkta trofoblast dellineages. Aberrant tidiga trophoblast differentiering kan leda till implantation misslyckande, placenta patologier, fetala avvikelser och missfall. Nyligen har metoder utvecklats för att tillåta mänskliga embryon att växa fram till dag 13 efter befruktning in vitro i avsaknad av moderns vävnader, en tidsperiod som omfattar implantation perioden hos människor. Detta har gett forskare möjlighet att undersöka människans implantation och rekapitulera dynamiken i trophoblast differentiering under denna kritiska period utan att blanda ihop moderns influenser och undvika inneboende hinder för att studera tidiga embryodifferentiering händelser in vivo. För att karakterisera olika trophoblast sublineages under implantation, har vi antagit befintliga tvådimensionella (2D) utökade odlingsmetoder och utvecklat ett förfarande för att enzymatiskt smälta och isolera olika typer av trofoblast celler för nedströms analyser. Embryon odlade i 2D-villkor har en relativt tillplattad morfologi och kan vara suboptimala i modellering in vivo tredimensionella (3D) embryonala arkitekturer. Trophoblast differentiering verkar dock vara mindre påverkas som framgår av förväntade morfologi och genen förändringar uttryck under loppet av utökade kultur. Olika trofoblast dellinjer, inklusive cytotrophoblast, syncytiotrophoblast och flyttande trofoblast kan separeras med storlek, plats och tidsmässiga uppkomst, och används för ytterligare karakterisering eller experiment. Utredning av dessa tidiga trophoblast celler kan vara avgörande för att förstå mänskliga implantation, behandla vanliga placenta patologier och mildra förekomsten av graviditet förlust.

Friska embryon uppvisade fortsatt spridning under loppet av utvidgad kultur (Figur 2B). Onormala embryon började dra sig tillbaka från sina ytterkanter och upplösas (Figur 2C). Från vår erfarenhet var ungefär 75% av embryon knutna till botten av fibronectin belagda skålen vid 48 h och fastsättning ökade till cirka 90% med 72 h i kultur. Framgången för embryotillbehör kan till stor del påverkas av den ursprungliga kvaliteten på blastocysts. Embryon ...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Här beskriver vi en metod för uppvärmning förglasade mänskliga blastocyster, culturing dem genom implantationsperioden in vitro, smälta dem i enstaka celler och samla tidiga trophoblast celler för vidare utredning.

Single Cell Insamling av Trophoblast celler i Peri-implantation Stage mänskliga embryon

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Många graviditeter misslyckas tidigt i mänskliga embryot utveckling runt de sju eller åtta efter befruktning. Detta protokoll erbjuder möjligheter till utredare att växa mänskliga konceptorer in vitro under denna mystiska implantation fönster. Detta gör det möjligt för oss att förstå de mekanismer som ligger till grund för framgången för mänsklig implantation och tidig placentabildning.Att använda ett utökat odlingssystem för att odla peri-implantationsstadium mänskliga embryon in vitro är förmodligen det enda sättet att få autentiska material att studera implantation och tidig trophoblast differentiering. Denna enkla teknik är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för oss att svara på många grundläggande frågor om mänsklig tidig utveckling. Forskning som bedrivs med användning av detta protokoll kommer till stor del att bidra till förståelsen av tidig graviditet förlust, återkommande implantation misslyckande och moderkakan patologier.Demonstrera förfarandet kommer att Deirdre Logsdon, doktorand från ett laboratorium. En dag före embryot uppvärmningen, förbereda media och plattor återhämtning i en steril laminär flöde huva. Fyll två center väl orgel kultur diska med 500 mikroliter bm med 10%SPS, sedan täcka BM med 500 mikroliter av embryokultur grade olja.I en 16 millimeter vävnad kultur skålen, lager åtta milliliter av embryo kultur olja och ankare 20 microliter droppar BM med 10%SPS till botten. Jämvikt diska och återvinning tallrik i en inkubator vid 37 grader Celsius, 6%koldioxid och 5%syre i minst fyra timmar. Aliquot cirka fyra milliliter av IVC 1 i en fem milliliter snap cap röret och förbereda en tvätt skålen med 500 mikroliter av IVC 1 utan olja overlay.Jämviktskålen och röret i inkubatorn i minst fyra timmar. Späd fibronectin från humant serum i PBS till 30 mikrogram per milliliter. Öppna de åtta välkammarede coverslip paketet noga med att inte röra brunnarna, sedan försiktigt pipetter 250 mikroliter av fibronectin i varje brunn.Sätt tillbaka locket på täcket och inkubera det i fyra grader Celsius i 20 till 24 timmar. Förbered den förlängda odlingsplattan på morgonen av embryots uppvärmning. Hämta den kammade luckan med fibronectin och placera den i laminär flödeshuven.Ta sedan bort fibronectin blandningen med en milliliter pipett och kassera den. Pipett 300 mikroliter av den ekviloliga IVC 1 i varje brunn och placera täckslip i inkubatorn tills avlägsnandet av zona pellucida. Efter uppvärmning och återvinning av D5 mänskliga embryon, bedöma dem för återexpansion och ta bilder av varje embryo.Flytta varje embryo till 500 mikroliter av ett MOPS-buffrat hanteringsmedium med 5%FCS. Behandla den sedan med surt Tyrodes lösning så som beskrivs i textmanuskriptet. Flytta omedelbart embryot med upplösningszona i 300 mikroliter av värmt MOPS buffrat medium för att släcka Tyrode lösning.Flytta sedan embryot till en central väl organvävnadsskål som innehåller den ekvilovilliga BM med 10%SPS under embryokulturens kvalitet olja. Sedan tillbaka embryot till 20 microliter återhämtning droppe. Individuellt flytta embryon till tvätt skålen med ekvilovilliga IVC 1 media, sedan försiktigt flytta varje embryo till en brunn av den kamrade täckplattan, se till att hålla reda på embryot identifiering.Returnera den kammade täckplattan till en inkubator inställd på 37 grader Celsius, 6% koldioxid och atmosfäriskt syre i två dagar. Vid utväxt dag två, noggrant undersöka kvarstad på embryona under mikroskopet och utbyta media. Vet vilket embryo som är fäst vid skålen genom att försiktigt knacka på plattan.För att byta media, ta bort locket och försiktigt aspirera 150 mikroliter av IVC 1, var noga med att inte störa det bifogade embryot. Om ett embryo ännu inte har fästs på plattan, inte byta media eftersom serumet i IVC 1 kommer att stöd i kvarstad. Långsamt pipettera 150 mikroliter av ekviloförlängda odlingsmedier, IVC 2 i varje brunn och Byt ut locket på täcket.Försiktigt tillbaka den kammade täckslip till inkubatorn. Upprepa media utbyte och bifogad fil kontrollera varje dag tills embryon är redo för fixering eller encellig matsmältning. Om insamling av förbrukade medier är nödvändig för ytterligare analys, snap frysa de 150 mikroliter av bort IVC 1 i en steril låg binda 0,5 milliliter rör.Tvätta varje embryo en gång med 200 mikroliter PBS, tillsätt sedan 200 mikroliter trypsinlösning till varje brunn. Returnera den kammade täckplattan till inkubatorn i fem minuter. Använd en liten pipett eller fint dragna munpipett för att plocka upp en enskild MTB sedan använda en större pipett för att försiktigt dissociate embryot genom att aspirera upp och ner.Fortsätt aspirera embryot försiktigt och upprepade gånger med hjälp av en pipettspets med mindre diameter tills embryot har inkuberas i totalt 10 minuter i trypsin. För att utföra encellsval, flytta de dissocierade cellerna genom 320 microliter tvätt droppar PBS och 0,1%PVP under embryokultur olja, var noga med att inte förlora några celler. Efter tvättning cellerna använder en fint drog glaspipett för att välja en cell.Försiktigt pipettera den enda cellen till ett sterilt 0,2 milliliter lågrör med en minimal volym PBS och PVP. Snap fria enstaka celler i flytande kväve och lagra dem vid negativa 80 grader Celsius för vidare användning. Friska embryon uppvisade fortsatt spridning under loppet av utökad kultur, medan onormala embryon började dra sig tillbaka från sina yttre kanter och upplösas.Vid dag åtta post befruktning, de flesta celler i embryon var cytotrophoblast eller CTBs, som var positiva för trophoblast markör GATA-3. På peripheryen av embryot var CTBna redan att göra åtskillnad mellan in i multi-nucleated syncytiotrophoblasts, som hade ett täcker något liknande utseendemässigt och färgat realitet för människor CGB. Vid dag 10, bildandet av CGB positiva flyttande trophoblast celler var på en maximal, vilket bekräftades av uppgången av HCG produktion vid denna tidpunkt.Flyttande trofoblaster som färgas positivt för HLA-G, började också att dyka upp och migrera bort från embryot kroppen. Vid dag 12, STB differentiering var på tillbakagång och MTB produktionen blev mer framträdande, vilket tyder på en förskjutning av betoning från hormonproduktion på dag 10 till cell migration på dag 12. Dessa förändringar kan observeras i en time lapse video av peri-implantation perioden.Videon visar kollapsen av blastocele, bildandet av STB, och den eventuella differentiering och migration av MTB. Det viktigaste att tänka på när du slutför detta förfarande är att du arbetar med levande embryon som är känsliga för förändringar i temperatur, osmolalitet och pH. Att minimera den tid som disken är ute ur inkubatorn är avgörande för att upprätthålla embryots hälsa.Efter att ha slutfört detta förfarande, utredare kan använda isolerade enstaka celler för nedströms enda cell omics analyser, såsom single cell RNA sekvensering och hela genomet bisulfitsekvensering för att bättre förstå epigenetiska och transkriptomiska förändringar under mänsklig implantation och tidig moderkakan bildning.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Beredning av Neuronal kulturer från Midgastrula Stage Drosophila embryon

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Placering Growth Factor-Coated Pärlor på tidiga embryon Stage Kyckling

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

I Ovo Electroporations av HH Stage 10 kycklingembryon

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Härledning av Stem Mus trofoblasten Celler från Blastocyster

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

Single Cell Transfektion i kycklingembryon

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Kromatin Immunoprecipitation analys för Tissue-specifika gener med början av karriären musembryon

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolering av primära celler Mus trofoblaster och trofoblaster Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...