Name: single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Colorado Üreme Tıbbı Merkezi'ndeki (CCRM) embriyolarını nazikçe araştırma için bağışlayan birçok hastaya teşekkür etmek istiyoruz. Biz de Karen Maruniak ve CCRM klinik laboratuvar hCG örnekleri işleme yardımları için teşekkür etmek istiyorum, yanı sıra Sue McCormick ve CCRM onun klinik IVF embriyoloji ekibi embriyo toplama, depolama, izleme ve bağış ile yardım için. Finansman ccrm tarafından dahili olarak sağlanmıştır.

Tüm insan embriyoları araştırmada kullanılmak üzere rıza ile bağışlanmıştır. Genişletilmiş insan embriyosu kültürü için protokoller Batı Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma no. 1179872) tarafından onaylanmıştır ve uluslararası yönergeleri izleyin. İnsan embriyolarının herhangi bir şekilde kullanımı, bu protokolü kullanarak araştırma kurumuyla ilişkili uygun etik ve yönetim organları tarafından gözden geçirilmelidir.
1. Hazırlık
<ol><li>Steril lami...

<ol>
	<li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+placentation--a+review.">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , 41-47 (2007).</li><li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+placentation+and+animal+models:+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report.">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li><li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals.">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li><li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro.">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation.">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li><li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate.">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo.">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation.">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li><li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses.">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).</li><li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos.">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li><li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos.">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li><li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university.">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li><li>Buettner, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Franklin+Paine+Mall+(1862-1917).">Franklin Paine Mall (1862-1917).</a> Embryo Project Encyclopedia. , (2007).</li><li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Contributions to embryology. , (1915).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development.">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li><li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts.">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li></ol>

Implantasyon yoluyla kültür insan embriyoları için protokolün geliştirilmesi bilim adamları geliştirme daha önce keşfedilmemiş bir zaman keşfetmek için izin verdi8,9. Burada, insan embriyolarını kültürlendirmek ve villous plasenta oluşumundan önce erken trofoblast farklılaşmasını incelemek için genişletilmiş bir kültür sistemi kullanıyoruz. Burada açıklanan yöntemler, tek hücreli alt akış analizinde kullanılmak üzere farklı T...

İnsan implantasyonu ve erken plasentanın ortaya çıkması tarihsel olarak araştırmak zordur ve büyük ölçüde bilinmemektedir çünkü gebelik klinik olarak saptanamayan bu aşamada insan dokularına erişilemez. Hayvan modelleri yetersizdir, çünkü insan plasentasyonu diğer öther memelilere göre kendine özgü özelliklere sahiptir. Örneğin, insan plasenta diğer hücreler rahim spiral arterler remodel ise bazı trofenlast hücreleri rahim miyometrium en az iç üçte ulaşan ile yaprak içine derinden işgal. Hatta en yakın evrimsel atalarımız, insan olmayan primatlar, plasental morfoloji ve trofenlast etkileşimleri maternal desidualdokular1,2,3ile farklılıklar göstermektedir. 1980'li yıllarda klinik insan in vitro fertilizasyon (IVF) kısırlık tedavisinde rutin bir uygulama olarak başlayana kadar in vitro pre-implantasyon insan embriyolarının in vitro elde edilmesi mümkün değildi4. Şimdi, insan blastosistleri transfer için daha uygun embriyoların seçimi için izin vermek için in vitro yetiştirilebilir, hem de güvenli genetik test sağlamak. Embriyo kültürü tekniklerinde iyileşme, hem de IVF artan kullanımı hastanın tedavi döngüleri tamamlandıktan sonra kalır birçok artı blastosistler vermiştir. Hastanın onayı, IRB onayı ve bazı kısıtlamalar ile bu blastosistler araştırma çalışmaları için kullanılabilir. Onlar insan embriyonik kök hücrelerin türevi için kullanılan paha biçilmez bir kaynak haline gelmiştir5, embriyonik kök hücrelere iç hücre kütlesinin geçiş anlayışı6,7, ve daha yakın zamanda, başarıyla güne kadar kültürlü olmuştur (D) 13 insanimplantasyonuremodel 8,9. Son zamanlarda geliştirilen tek hücreli omik yaklaşımlar kullanarak, Bu implantasyon aşamasında insan embriyo dokularına erişim daha önce10keşfetmek imkansız olan bu son derece dinamik hücre farklılaşma sürecini düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunmuştur 10,11,12,13.
Burada, insan implantasyonu sırasında trophoblast farklılaşmasının dinamiklerini karakterize eden son yayınımızda kullanılan yöntemleri açıklıyoruz12. Bu protokol vitrifiye blastosistlerin ısınmasını, D12 sonrası IVF'ye kadar uzatılmış embriyo kültürünü, embriyonun tek hücrelere enzimatik sindirimini ve aşağı akım tahlilleri için hücre toplamayı içerir (Şekil 1). Bu genişletilmiş kültür sistemi anne girişi olmadan peri-implantasyon aşamasında insan embriyo gelişimini destekler ve yıllar önce histolojik örneklerden yapılan gözlemler ile tutarlı görünen trophoblast farklılaşması özetler14,15,16,17. İmplantasyon sırasında trofoblast popülasyonu en az iki hücre tipinden oluşur: mononükleli progenitor benzeri sitotrophoblast (CTB) ve ölümcül diferansiye, multinükleatlı sintiyotrophoblast (STB). Tripsin sindirimi üzerine, CTB morfolojik olarak diğer hücre soylarından ayırt edilemeyen küçük yuvarlak hücrelerdir(Şekil 2A, sol panel). CTB'nin epiblast ve ilkel endoderm gibi diğer hücre soylarından ayrılması, tek hücreli RNA dizilimi ile ortaya çıkan farklı transkripsiyon profilleri ile elde edilebilir. Syncytiotrophoblast hücreleri kolayca diğer hücre tiplerinden önemli ölçüde daha büyük ve esas olarak embriyo nun çevresinde bulunan düzensiz şekilli yapılar olarak tanımlanabilir (Şekil 2A, orta panel; Şekil 2B, sol panel). Göçmen trofoblast hücreleri (MTB) embriyo genişletilmiş kültür sırasında bulunan başka bir trofoblast alt çizgi ve görünüşte embriyoana gövdesinden hareket olarak kabul edilebilir(Şekil 2A, sağ panel, Şekil 2B, sağ panel). Göçmen trofoblast, ekstra villous trofoblast (EVT) ile aynı belirteçlerin çoğunu ifade etmesine rağmen, plasentadaki villous yapılar gelişmenin bu çok erken evresinde ortaya çıkmadığından, EVT olarak adlandırılmamalıdır.
Deneysel olarak, embriyolar D8, D10 ve D12'de tek hücrelere sindirildikten sonra kolayca ayırt edilebilen küçük CTB ve büyük STB'yi toplayabildik(Şekil 2A,B). Göçmen trofoblastlar genişletilmiş embriyo kültürünün ileri evrelerinde ortaya çıkar ve tüm embriyonun enzimatik sindiriminden önce D12'de toplanabilir(Şekil 2A,B). Bu üç trofoblast alt çizgisini tek hücre analizinden önce fenotipik olarak ayırarak, spesifik transkripsiyonel belirteçleri ve her hücre türünün biyolojik rolünü tanımlayabiliriz. Sitotrophoblast son derece proliferatif ve STB ve MTB farklılaştırılmış soy10,11,,12,13temininde progenitor hücreleri olarak hareket. Syncytiotrophoblast gebelik korumak için plasental hormonlar üretiminde yer alan ve aynı zamanda endometrium içine oyuk embriyolar sorumlu olabilir10,11,12,13. Göçmen trofoblast bir invaziv, göçmen fenotip daha güçlü özelliklere sahiptir ve muhtemelen rahim endometrium10,11,,12,13daha derin ve daha geniş kolonizasyon sorumludur. Her hücre tipinin transkripsiyon analizi, her hücre tipinin transkripsiyon izini tanımladıktan sonra, ctb'den morfolojik olarak ayırt edilemeyen ve sırasıyla12'de STB ve MTB özelliklerine sahip transkripsiyonlara sahip iki ek hücre alt kümesini ortaya çıkarmış bulunmaktadır. Bu ara evre hücreler, CTB'den MTB veya STB alt geçitlerine ayırt etme sürecinde dir ve embriyolar körü körüne sindirilseydi ve hücreler tek başına transkripsiyonla ayrılsaydı gözden kaçırılırlardı.
Burada açıklanan protokol iki boyutlu (2D) kültür sistemi kullanır ve yeni geliştirilen 3D kültür sistemi13açıklayan yeni bir yayın tarafından önerilen üç boyutlu (3D) yapısal gelişimi desteklemek için en uygun olmayabilir. Yine de, bu 2D sistemde erken trofoblast farklılaşması in vivo örnekleri14,15,,16,17yapılan gözlemler ile tutarlı gibi görünüyor. Bu protokol, en az değişiklikle en son tanımlanan 3B kültür sistemi13'teki kullanıma da kolayca uyarlanabilir. Tüm adımlar, ticari olarak kullanılabilen tek kullanımlık uçlar veya kauçuk boru, filtre ve ağızlık bağlı ince çekilmiş cam pipet bir ağız pipet ile bir el mikromanipülasyon pipet ile gerçekleştirilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-038</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL snap cap tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-295</td>
			<td>Pack of 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Corning Primaria tissue culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-687</td>
			<td>Case of 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dish</td>
			<td>Agtech Inc.</td>
			<td>D18</td>
			<td>Pack of 1, 10, or 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotix 1250 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-156</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast, blastocyst culture media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83060010</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td>5.75 in. (146mm); 720/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo culture paraffin oil OvOil</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10029</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47730-598</td>
			<td>Pack of 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR tubes 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-980</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 1 mL Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 200-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 20 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson 200 &#181;L Pipetteman</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td>1 Pipetteman 50-200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-MOPS handling media</td>
			<td>Vitrolife</td>
			<td>10129</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling media</td>
			<td>Origio</td>
			<td>83100060</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi 8 well chambered coverslip</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>15 slides per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVC1/IVC2</td>
			<td>Cell Guidance Systems</td>
			<td>M11-25/ M12-25</td>
			<td>5-5mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K System T47 Warming Plate</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>23054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Pack of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td>100 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oosafe center well dish</td>
			<td>Oosafe</td>
			<td>OOPW-CW05-1</td>
			<td>Case of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinn&#39;s Advantage SPS</td>
			<td>Origio</td>
			<td>ART-3010</td>
			<td>12x 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber latex tubing for mouth pieces</td>
			<td>IVF Store</td>
			<td>IVFS-NRL-B-5</td>
			<td>5 ft.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper tips</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-275</td>
			<td>20/pk 275 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thawing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>2 x 4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Stripper Micropipetter</td>
			<td>Cooper Surgical</td>
			<td>MXL3-STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>1 x 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379-25ML</td>
			<td>25 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89174-526</td>
			<td>Pack of 960</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Solution</td>
			<td>Kitazato</td>
			<td>VT802</td>
			<td>1 x 4 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell collection of trophoblast cells in peri-implantation stage human embryos

İnsan implantasyonu, rahim yüzeyi epitelinin afipozve yapışıklığı ve blastosistin maternal decidua invazyonu, teknik ve etik sınırlamalar nedeniyle tarihsel olarak incelenmesi zor olan kritik ama esrarengiz bir biyolojik olaydır. İmplantasyon trophektoderm gelişimi ile erken trofoblast ve daha sonraki farklılaşma farklı trofoblast alt alt larına doğru başlatılır. Anormal erken trofoblast farklılaşması implantasyon yetmezliğine, plasental patolojilere, fetal anormalliklere ve düşüklere yol açabilir. Son zamanlarda insan embriyolarının, insanlarda implantasyon dönemini kapsayan bir zaman dilimi olan anne dokularının yokluğunda 13. Bu, araştırmacılara, anne etkilerini şaşırtmadan ve erken embriyo farklılaşma olaylarını in vivo'da incelemek için doğal engellerden kaçınmadan, bu kritik dönemde insan implantasyonunu araştırma ve trophoblast farklılaşmasının dinamiklerini özetleme fırsatı vermiştir. İmplantasyon sırasında farklı trofoblast alt çizgilerini karakterize etmek için, mevcut iki boyutlu (2D) genişletilmiş kültür yöntemlerini benimsedik ve alt akım tahlilleri için farklı tipte trofenlast hücrelerini enzimatik olarak sindirmek ve izole etmek için bir prosedür geliştirdik. 2B koşullarda kültürlenen embriyolar göreceli olarak düzleştirilmiş morfolojiye sahiptir ve in vivo üç boyutlu (3D) embriyonik mimarilerin modelilmesinde suboptimal olabilir. Ancak, trophoblast farklılaşması, genişletilmiş kültür boyunca beklenen morfoloji ve gen ekspresyonu değişikliklerinden de anlaşıldığı gibi daha az etkilenmiş gibi görünmektedir. Sitotrophoblast, syncytiotrophoblast ve göçmen trofoblast ı da dahil olmak üzere farklı trofoblast alt ları boyut, yer ve zamansal doğuşile ayrılabilir ve daha fazla karakterizasyon veya deney için kullanılabilir. Bu erken trofenlast hücrelerinin araştırılması insan implantasyonunun anlaşılmasında, yaygın plasental patolojilerin tedavisinde ve gebelik kaybı nın görülme sıklığının azaltılmasında etkili olabilir.

Sağlıklı embriyolar genişletilmiş kültür boyunca sürekli çoğalma sergilediler (Şekil 2B). Anormal embriyolar dış kenarlarından geri çekilmeye ve parçalanmaya başladılar (Şekil 2C). Deneyimlerimize göre embriyoların yaklaşık %75'i 48 saat le fibronektin kaplı kabın altına bağlanmış ve ek kültürde 72 saat ile yaklaşık %90'a yükselmiştir. Embriyo eki başarısı büyük ölçüde blastosistlerin ilk kalitesinden etkilenebilir. 72 ...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos at JoVE.com

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Birçok gebelik yedi veya sekiz post-fertilizasyon etrafında insan embriyo gelişiminde erken başarısız. Bu protokol, araştırmacılara bu gizemli implantasyon sırasında insan kavramlarını in vitro olarak yetiştirme fırsatı sunuyor. Bu bize insan implantasyonu ve erken plasental oluşumunun başarısını destekleyen mekanizmaları anlamak için izin verir.Peri-implantasyon aşamasında insan embriyoları in vitro büyümek için genişletilmiş bir kültür sistemi kullanarak muhtemelen implantasyon ve erken trophoblast farklılaşma çalışma otantik malzemeler elde etmek için tek yoldur. Bu basit teknik bize insan erken gelişimi hakkında birçok temel sorulara cevap sağlayan güçlü bir araçtır. Bu protokolün kullanımı ile yapılan araştırmalar, erken gebelik kaybı, tekrarlayan implantasyon başarısızlığı ve plasenta patolojilerinin anlaşılmasına büyük ölçüde katkıda bulunacaktır.Prosedürü gösteren Deirdre Logsdon, bir laboratuvardan doktora öğrencisi olacaktır. Bir gün önce embriyo ısınma, steril bir laminar akış başlık medya ve kurtarma plakaları hazırlamak. İki merkezi iyi organ kültürü% 10 SPS ile BM 500 mikrolitre ile yıkama yemekleri doldurun, sonra embriyo kültürü sınıf yağ 500 mikrolitre ile BM kapağı.16 milimetrelik doku kültürü çanak, embriyo kültür yağı tabaka sekiz mililitre ve çapa 20 mikrolitre BM damla ile 10% SPS altına. Yıkama bulaşıklarını ve geri kazanım plakasını en az dört saat boyunca 37 santigrat derece, %6 karbondioksit ve %5 oksijen le bir kuvözde dengeleyin. Aliquot yaklaşık dört mililitre IVC 1 beş mililitrelik bir çırpıda kapak tüp içine ve hiçbir yağ bindirme ile IVC 1 500 mikrolitre ile bir yıkama çanak hazırlamak.En az dört saat boyunca kuvözde çanak ve tüp dengeleyin. PBS'deki insan serumundan mililitrebaşına 30 mikrograma kadar fibronektin seyreltin. Kuyulara dokunmamaya özen tayarak sekiz iyi odalı kapaklı paketi açın, ardından her kuyuya 250 mikrolitre fibronektin pipeti yavaşça alın.Kapak kapağını değiştirin ve 20 ila 24 saat boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın. Embriyo ısınma sabahı genişletilmiş kültür plakası hazırlayın. Fibronektin ile odacıklı kapak kayma alın ve laminar akış kaputuna yerleştirin.Sonra bir mililitrelik pipet ile fibronectin karışımı çıkarın ve atın. Pipet 300 mikrolitre her bir kuyuiçine dengelemiş IVC 1 ve zona pellucida kaldırılana kadar kuvöz içine coverslip yerleştirin. Isınma ve D5 insan embriyolarının kurtarma sonra, yeniden genişleme için bunları değerlendirmek ve her embriyo nun fotoğraflarını çekmek.Her embriyoya 500 mikrolitre mops tamponlu kullanım ortamı %5 FCS ile taşıyın. Sonra metin el yazması açıklandığı gibi asidik Tyrode çözeltisi ile tedavi. Hemen Tyrode çözeltisi bastırmak için ısıtılmış MOPS tamponlu orta 300 mikrolitre içine eriyen zona ile embriyo taşıyın.Sonra embriyo kültür sınıf yağı altında% 10 SPS ile dengede BM içeren merkezi bir iyi organ dokusu çanak içine embriyo taşıyın. Sonra 20 mikrolitre lik iyileşme düşüşüne embriyoyu geri getirin. Tek tek elenmiş IVC 1 medya ile yıkama çanağı için embriyolar hareket ettirin, sonra dikkatle odacıklı coverslip bir kuyuya her embriyo taşımak, embriyo kimlik takip emin olun.Odacıklı kapak kaymasını 37 santigrat derece, %6 karbondioksit ve atmosferik oksijenolarak belirlenen bir kuluçka makinesine iki gün boyunca geri verin. Büyüme nin ikinci gününde, embriyoların mikroskop altında eki dikkatle inceleyin ve medya değişimi. Plakaya hafifçe dokunarak hangi embriyonun tabağa bağlı olduğunu bilin.Ortamı değiştirmek için kapağı çıkarın ve bağlı embriyoyu rahatsız etmemeye özen gösterip 150 mikrolitre IVC 1'i dikkatlice aspire edin. Bir embriyo henüz plakaya bağlı değilse, IVC 1'deki serum bağlanmaya yardımcı olacağı için ortam değiştirin. Yavaş yavaş pipet 150 mikrolitre liblibed genişletilmiş kültür medya, IVC 2 her kuyuya ve kapak kapağı değiştirin.Dikkatlice odacıklı kapak kayma kuvöze döndü. Embriyolar fiksasyon veya tek hücreli sindirim için hazır olana kadar her gün ortam değişimi ve eki kontrol tekrarlayın. Daha fazla analiz için harcanan ortamın toplanması gerekiyorsa, çıkarılan IVC 1'in 150 mikrolitresini steril bir düşük bağlama 0,5 mililitrelik tüpe tutturun.Her embriyo200 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın, sonra her kuyuya 200 mikrolitre tripsin çözeltisi ekleyin. Odacıklı kapak fişini beş dakika lığına kuvöze geri verin. Tek bir MTB almak için küçük bir pipet veya ince çekilmiş ağız pipet kullanın sonra yavaşça yukarı ve aşağı uyararak embriyo ayrıştırmak için daha büyük bir pipet kullanın.Embriyo tripsin içinde toplam 10 dakika kuluçkaya yatana kadar daha küçük çaplı pipet ucunu kullanarak embriyoyu hafifçe ve tekrar tekrar kullanmaya devam edin. Tek hücre seçimi gerçekleştirmek için, herhangi bir hücre kaybetmemeye dikkat alarak, embriyo kültür yağı altında PBS ve% 0.1 PVP 320 mikrolitre yıkama damla ile ayrıştırılmış hücreleri hareket ettirin. Hücreler yıkandıktan sonra bir hücre seçmek için ince çekilmiş cam pipet kullanın.Tek hücreyi, pbs ve PVP hacmi en az olan steril 0,2 mililitrelik düşük bağlama tüpüne dikkatlice pipetlayın. Sıvı nitrojen serbest tek hücreleri snap ve daha fazla kullanım için negatif 80 santigrat derece saklayın. Sağlıklı embriyolar genişletilmiş kültür boyunca sürekli çoğalma sergilerken, anormal embriyolar dış kenarlarından geri çekilmeye ve parçalanmaya başladılar.Sekizinci gün döllenme sonrası, embriyolarda çoğu hücre sitotrophoblast veya CTBs, bu trhoblast marker GATA-3 için pozitif idi. Embriyonun çevresinde, CTB'ler zaten çok çekirdekli senytiotrophoblastlar, görünüm gibi bir levha vardı ve insanlar Için pozitif vitral. 10. günde, CGB pozitif göçmen trofoblast hücrelerinin oluşumu maksimum, bu zamanda HCG üretiminin yükselişi ile doğrulandı.HLA-G pozitif boyanmış göçmen trofoblastlar da ortaya çıkmaya ve embriyo gövdesinden uzaklaşmaya başladılar. 12. gün itibariyle STB farklılaşması azaldı ve MTB üretimi daha belirgin hale geldi ve 10. Bu değişiklikler peri-implantasyon döneminin zaman atlamalı videosunda görülebilir.Video blastocele çöküşünü gösterir, STB oluşumu, ve nihai farklılaşma ve MTB göç. Bu işlemi tamamlarken akılda tutulması gereken en önemli şey, sıcaklık, osmolalite ve pH değişikliklerine duyarlı canlı embriyolar ile çalışıyor olmasıdır. Bulaşıkların kuvözdışında olduğu süreyi en aza indirmek embriyo sağlığını korumak için çok önemlidir.Bu prosedürü tamamladıktan sonra, araştırmacılar, insan implantasyonu ve erken plasenta oluşumu sırasında epigenetik ve transkripsiyonel değişiklikleri daha iyi anlamak için tek hücreli RNA dizilimi ve tüm genom bisülfit dizilimi gibi tek hücreli omik testler için izole edilmiş tek hücreleri kullanabilirler.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...