Selv som genredigering er blevet populært for at studere den molekylære genetik af ikke-model organismer, RNAi er fortsat en kraftfuld synergistisk værktøj. Den største fordel ved denne teknik er, at det kan anvendes på forskellige udviklingsstadier. Desuden kan delvis knockdown bruges til at studere hele disse gener.
Procedurens succes afhænger af injektion af DSR og minimal skade. Dette tager praksis, så du skal ikke blive afskrækket, hvis det tager et par forsøg på at få det rigtige. For at forberede tidlige embryoner til mikroinjektion, først hælde kogende 20% agarose i en lille petriskål og placere tre en til to millimeter brede plastrør på overfladen af væsken agarose før det størkner.
Når agarose har størknet bruge et par stumpe kraftvipper til at fjerne rørene og dække de resulterende fordybninger med 500 mikroliter autoklave destilleret vand. Når indsamlingsbeholderen er klar, skal der bruges en fin naturlig hårmalingsbørste til at overføre fem otte timer gamle T.marmoratus-embryo fra billeens redepladser til en glashuleskål fyldt med autoklavedestilleret vand under et stereomikroskop. Brug af mikroskop og fine dissektionsforkreter forstå chorion af hvert foster fra begge sider og rip chorion åben tillader fosteret at glide forsigtigt ud af vævet.
Efter fjernelse af begge chorion lag fra alle de indsamlede embryoner bruge pensel til omhyggeligt at overføre embryoner fra glas hulrum parabol i rillerne på den forberedte agarose plade. At injicere tidlige embryoner med genspecifikke dobbeltstrengede RNA første forberede mikroinjektion nåle på en nål og bruge stereomikroskop og finde kraftforspring til at bryde hver spids til en skarp kant. Efter at have kastet den rensede bestand dobbeltstrenget RNA af interesse på is, tilsættes en mikroliter på 10X injektionsbuffer til den resulterende opløsning og brug dobbelt destilleret vand til at bringe vinylvolumen af opløsningen til 10 mikroliter.
Brug en P10-pipette til at fylde en af de forberedte mikroinjektionsnåle med den arbejdende dobbeltstrengede RNA-løsning og indlæs nålen i en mikronåleholder, der er forbundet til et mikroinjektionssystem, der anvender trykudslyngningsteknologi. Tænd for mikroinjektionssystemet og tryklufttilførslen, og brug mikroventilen på mikroinjektionssystemet til at indstille indsprøjtningstrykket til 15 pund tryk pr. kvadrattomme, og brug derefter tidsjusteringsknappen til at indstille injektionsvarigheden til sekunder. For at kalibrere injektionsnålen skal du vurdere mængden af den væskeboble, der dannes på spidsen af nålen, når den injiceres i luft for T.marmoratus-embryon, ved hjælp af en optimal boblestørrelse på 100 til 200 mikron.
Injektionsnålen er af god kvalitet, hvis optimale bobler kan opnås ved 15 pounds af tryk per kvadrattomme med en injektion varighed på omkring tre sekunder. Når nålen sat op er klar justere nålen på agarose plade af embryoner, således at nålen nærmer embryonerne i en 45 til 60 graders vinkel. Brug mikromanipulatoren til langsomt at flytte mikronålen, indtil spidsen rører overfladen af midten af et foster, og flyt forsigtigt nålen fremad, indtil den bare gennemborer embryonets overflade.
Når nålen er inde i fosteret, skal du trykke på mikroinjektorinjektionsknappen for at levere en til to nanoliter dobbeltstrenget RNA i fosteret. Når hele RNA'et er leveret langsomt trække nålen tilbage fra fosteret uden at få fosteret til at briste. Vellykket injiceres embryoner kan identificeres ved tilstedeværelsen af en farvet plet på injektionsstedet.
Når alle embryoner er blevet injiceret omhyggeligt placere skålen i en fugtighed kammer i en 25 grader Celsius inkubator sat til en 14 timers lys 10 timers mørk cyklus i fire til fem dage. Overvåg embryoudviklingen dagligt under stereomikroskopet for at identificere morfologisk synlige knockdown fænotyper. Brug af et digitalt kamera i høj opløsning til at dokumentere udviklingsprocessen.
Affjedræns alle døde embryoner, og genopfyld vandet på agarosepladen dagligt for at undgå udsætning og spredning af mikrobiel forurening til andre overlevende embryoner i inkubationstiden. Før indsamling af larver først tilføje 60 til 70 grader Celsius 2% flydende agarose til en lille petriskål. Når agarose har størknet brug stumpe kraftker til at gøre en lavvandet gruppe per larver, der skal injiceres i agarose og forsigtigt dræne vandet fra larver kultur kopper.
Efter anæstesi bruge bløde ended forcer til omhyggeligt at placere larverne på immobilisering plade med hals og organer i rillerne, men halen placeret over agarose overfladen. Når alle larver var blevet placeret, dække hver lava med et tykt lag af agarose, der stadig er flydende, men ikke faretruende varmt og fri nogen fortællinger, der ved et uheld blev dækket efter behov. for en dobbeltstrenget RNA mikroinjektion belastning en mikroneedle med genspecifikke dobbeltstrengede RNA arbejdsløsning af interesse som påvist.
Redrag stemplet af en manuelt styret mikroinjektion sprøjte og læg nålen på mikroinjektionssystemet. Placer den immobiliserede larver under stereomikroskopet, så injektionsstedet flugter med mikroinfektionsnålens bane i en relativt flad vinkel. Brug mikromanipulatoren til forsigtigt at flytte kanylespidsen ind i larven og langsomt og forsigtigt trykke på sprøjten og justere injektionstrykket i henhold til bevægelsen af den farvede injektionsvæske i nålen efter behov.
Når alle RNA er blevet injiceret bruge bløde kræfter til at frigøre larven fra agarose og placere larv i en ny beholder med stuetemperatur vand ved 25 til 28 grader Celsius og en 14 timers lys 10 timers mørk cyklus. I denne repræsentative analyse tre forskellige gener blev slået ned på en række forskellige udviklingsstadier af sunburst dykning bille T.marmoratus. RNA-interferens udføres som påvist ved at injicere dobbeltstrenget RNA på et meget tidligt stadium af embryogenese.
Nogle af embryonerne overlever ikke processen og bliver nekrotiske. I disse billeder de styrer individuelle og en person med en lidt lysere øjenfarve kan observeres. I denne person, en mere alvorlig knockdown, hvor de mere ventrale løgne i klyngen er helt unpigmented men do allierede stadig vise nogle pigmentering kan observeres.
Her et eksempel på en anden person med stort set komplet pigment tab i alle øjnene er vist. Lac2 slået ned i larver resulterer i en mindre pigmenteret neglebånd, lettere voksne personer med noget deforme vinger sandsynligvis på grund af den usædvanlige blødhed af vævet blev også opnået. Sørg for at se ivrigt at nøje observere dine injicerede dyr på daglig basis og til straks at fjerne eventuelle døde personer.
Kraften i denne teknik er, at det kan anvendes på gener af mange forskellige organismer. Denne teknik er også blevet bredt og med succes anvendt til evolutionær udviklingsbiologi.