विशिष्ट विकासात्मक समय बिंदुओं पर जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में जलीय बीटल में आरएनए हस्तक्षेप

यहां तक कि जीन संपादन गैर-मॉडल जीवों की आणविक आनुवंशिकी का अध्ययन करने के लिए लोकप्रिय हो गया है, आरएनएआई एक शक्तिशाली सहक्रियात्मक उपकरण बना हुआ है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि इसे विभिन्न विकास चरणों पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा इन पूरे जीन का अध्ययन करने के लिए आंशिक नॉकडाउन का इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रक्रिया की सफलता डीएसआर के इंजेक्शन पर निर्भर करती है और न्यूनतम नुकसान होता है। यह अभ्यास लेता है, तो अगर यह कुछ प्रयास करने के लिए इसे सही हो लेता है निराश नहीं है । माइक्रो इंजेक्शन के लिए प्रारंभिक चरण के भ्रूण तैयार करने के लिए, पहले उबलते 20% एक छोटे पेट्री पकवान में agarose डालना और तरल agarose की सतह पर तीन से दो मिलीमीटर चौड़ा प्लास्टिक ट्यूब जगह इससे पहले कि यह जमना ।

एक बार एगर उठे ट्यूबों को हटाने और ऑटोक्लेव आसुत पानी के 500 माइक्रोलीटर के साथ परिणामस्वरूप इंडेंटेशन को कवर करने के लिए कुंद संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। जब संग्रह कंटेनर तैयार है एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत ऑटोक्लेव आसुत पानी से भरा एक गिलास गुहा पकवान में बीटल घोंसले साइटों से पांच आठ घंटे पुराने टी मार्मोरेटस भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए एक ठीक प्राकृतिक बाल पेंट ब्रश का उपयोग करें । माइक्रोस्कोप और ठीक विच्छेदन संदंश का उपयोग दोनों पक्षों से प्रत्येक भ्रूण के chorion समझ और chorion खुला चीर भ्रूण धीरे ऊतक से बाहर स्लाइड करने के लिए अनुमति देता है ।

सभी एकत्र भ्रूण से दोनों कोरीन परतों को हटाने के बाद पेंटब्रश का उपयोग ध्यान से तैयार agarose प्लेट के खांचे में कांच गुहा पकवान से भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए । जीन विशिष्ट डबल फंसे आरएनए के साथ प्रारंभिक चरण भ्रूण इंजेक्ट करने के लिए पहले एक सुई पुलर पर माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयार करते हैं और स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं और प्रत्येक टिप को तेज किनारे पर तोड़ने के लिए संदंश पाते हैं। बर्फ पर ब्याज की शुद्ध स्टॉक डबल फंसे आरएनए फेंकने के बाद, परिणामी समाधान के लिए 10X इंजेक्शन बफर का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और 10 माइक्रोलीटर के लिए समाधान की विनाइल मात्रा लाने के लिए डबल आसुत पानी का उपयोग करें।

काम कर रहे डबल फंसे आरएनए समाधान के साथ तैयार माइक्रोइंजेक्शन सुइयों में से एक को बैकफिल करने के लिए P10 पिपेट का उपयोग करें और सुई को माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम से जुड़े माइक्रोनीडल धारक में लोड करें जो दबाव इंजेक्शन तकनीक का उपयोग करता है। माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम और दबाव वाली हवा की आपूर्ति को चालू करें और इंजेक्शन दबाव को प्रति वर्ग इंच 15 पाउंड दबाव में सेट करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम पर माइक्रो वाल्व का उपयोग करें, फिर इंजेक्शन अवधि को सेकंड में सेट करने के लिए समय समायोजन घुंडी का उपयोग करें। इंजेक्शन सुई को कैलिब्रेट करने के लिए द्रव बुलबुले की मात्रा का आकलन करें जो सुई की नोक पर बनता है जब टी मार्मोरेटस भ्रूण के लिए हवा में इंजेक्शन 100 से 200 माइक्रोन के इष्टतम बुलबुले के आकार का उपयोग करें।

इंजेक्शन सुई अच्छी गुणवत्ता की है अगर इष्टतम बुलबुले के बारे में तीन सेकंड की एक इंजेक्शन अवधि के साथ प्रति वर्ग इंच दबाव के 15 पाउंड में प्राप्त किया जा सकता है । जब सुई सेट अप तैयार है भ्रूण की agarose प्लेट पर सुई संरेखित करें जैसे कि सुई एक 45 से 60 डिग्री कोण पर भ्रूण दृष्टिकोण। माइक्रो मैनिपुलेटर का उपयोग धीरे-धीरे माइक्रोनीडल को स्थानांतरित करने के लिए जब तक टिप एक भ्रूण के बीच की सतह को छू रहा है तो ध्यान से सुई को आगे बढ़ाएं जब तक कि यह भ्रूण की सतह को छेदता न हो।

एक बार सुई भ्रूण के अंदर है ध्यान से माइक्रो इंजेक्टर इंजेक्शन बटन दबाने के लिए भ्रूण में डबल फंसे आरएनए के एक से दो नैनोलीटर उद्धार । जब आरएनए के सभी धीरे से भ्रूण टूटना करने के लिए कारण के बिना भ्रूण से सुई वापस ले दिया गया है । इंजेक्शन की साइट पर एक रंगीन स्थान की उपस्थिति से सफलतापूर्वक इंजेक्शन भ्रूण की पहचान की जा सकती है।

जब भ्रूण के सभी इंजेक्शन दिया गया है ध्यान से एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक आर्द्रता कक्ष में पकवान जगह एक 14 घंटे प्रकाश 10 घंटे अंधेरे चक्र के लिए चार से पांच दिनों के लिए सेट । रूपात्मक रूप से दिखाई देने वाले नॉकडाउन फेनोटाइप की पहचान करने के लिए स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदिन भ्रूण विकास प्रगति की निगरानी करें। विकास प्रक्रिया को दस्तावेज करने के लिए एक उच्च संकल्प डिजिटल कैमरे का उपयोग करना।

किसी भी मृत भ्रूण को निकालें और इनक्यूबेशन अवधि के दौरान अन्य जीवित भ्रूण के लिए desiccation और माइक्रोबियल संदूषण के प्रसार से बचने के लिए प्रतिदिन एगर उठे प्लेट पर पानी की भरपाई करें। लार्वा इकट्ठा करने से पहले पहले एक छोटे पेट्री डिश में 60 से 70 डिग्री सेल्सियस 2% तरल एग्राजड हो जाता है। जब एगर उठे ने प्रति लार्वा एक उथले समूह को एगर उठी में इंजेक्ट करने और लार्वा संस्कृति कप से पानी को धीरे-धीरे निकालने के लिए उपयोग कुंद संदंश का जम गया है।

संज्ञाहरण के बाद नरम समाप्त संदंश का उपयोग करने के लिए ध्यान से नाली में गर्दन और शरीर के साथ स्थिरीकरण प्लेट पर लार्वा जगह है लेकिन सतह के ऊपर स्थित पूंछ । जब सभी लार्वा रखे गए थे, तो प्रत्येक लावा को एक मोटी परत के साथ कवर करें जो अभी भी तरल है लेकिन खतरनाक रूप से गर्म नहीं है और किसी भी कहानियों को मुक्त नहीं करता है जिसे गलती से आवश्यक रूप से कवर किया गया था। एक डबल फंसे आरएनए माइक्रोइंजेक्शन के लिए जीन विशिष्ट डबल फंसे आरएनए के साथ एक माइक्रोनीडल लोड ब्याज के समाधान के रूप में प्रदर्शन किया ।

मैन्युअल रूप से नियंत्रित माइक्रोइंजेक्शन सिरिंज के प्लंजर को रेडरग करें और सुई को माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम पर लोड करें। स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे स्थिर लार्वा की स्थिति ऐसी है कि इंजेक्शन साइट अपेक्षाकृत सपाट कोण पर माइक्रोइंजेक्शन सुई के प्रक्षेपवक्र के साथ गठबंधन किया जाता है। सुई टिप को सावधानीपूर्वक लार्वा में ले जाने के लिए माइक्रो मैनिपुलेटर का उपयोग करें और धीरे-धीरे और सिरिंज पर दबाव लागू करें, सुई में रंगीन इंजेक्शन तरल पदार्थ के आंदोलन के अनुसार इंजेक्शन दबाव को आवश्यक रूप से समायोजित करें।

जब आरएनए के सभी इंजेक्शन किया गया है नरम संदंश का उपयोग करने के लिए agarose से लार्वा मुक्त और कमरे के तापमान पानी के एक नए कंटेनर में लार्वा 25 से 28 डिग्री सेल्सियस और एक 14 घंटे प्रकाश 10 घंटे अंधेरे चक्र में जगह है । इस प्रतिनिधि विश्लेषण में सनबर्स्ट डाइविंग बीटल टी मार्मोरेटस के विभिन्न विकासात्मक चरणों में तीन अलग-अलग जीन नीचे खटखटाए गए थे। आरएनए हस्तक्षेप भ्रूणजेनेसिस के एक बहुत ही प्रारंभिक चरण में डबल फंसे आरएनए इंजेक्शन द्वारा प्रदर्शन के रूप में किया जाता है ।

कुछ भ्रूण प्रक्रिया से जीवित नहीं रहते हैं और परिगलित हो जाते हैं। इन छवियों में वे व्यक्तिगत को नियंत्रित करते हैं और थोड़ा हल्का आंखों के रंग वाले व्यक्ति को देखा जा सकता है। इस व्यक्ति में, एक अधिक गंभीर नॉकडाउन जिसमें क्लस्टर का अधिक वेंट्रल झूठ पूरी तरह से अनपिगमेंट किया जाता है लेकिन क्या सहयोगी अभी भी कुछ पिगमेंटेशन दिखाते हैं।

यहां आंखों के सभी में अनिवार्य रूप से पूर्ण वर्णक हानि के साथ एक और व्यक्ति का एक उदाहरण दिखाया गया है। लैक् 2 ने लार्वा परिणाम में कम वर्णक क्यूटिकल में दस्तक दी, ऊतक की असामान्य कोमलता के कारण कुछ विकृत पंखों के साथ हल्का वयस्क व्यक्ति भी प्राप्त किए गए। दैनिक आधार पर अपने इंजेक्शन वाले जानवरों का बारीकी से निरीक्षण करने और किसी भी मृत व्यक्तियों को तुरंत हटाने के लिए उत्सुकता से देखना सुनिश्चित करें।

इस तकनीक की शक्ति यह है कि इसे कई अलग-अलग जीवों के जीन पर लगाया जा सकता है। इस तकनीक को विकासवादी विकासात्मक जीव विज्ञान पर भी व्यापक रूप से और सफलतापूर्वक लागू किया गया है।