遺伝子編集が非モデル生物の分子遺伝学を研究するために普及しているとしても、RNAiは依然として強力な相乗ツールです。この手法の主な利点は、異なる発達段階に適用できることです。さらに、部分的なノックダウンを使用して、これらの全遺伝子を研究することができます。
手順の成功は、DSRの注入と最小限の害を持つことに依存しています.これは練習を必要とするので、それを正しくするために数回の試みが必要な場合は落胆しないでください。マイクロインジェクションのために初期段階の胚を準備するには、まず沸騰した20%アガロースを小さなペトリ皿に注ぎ、固化する前に液体アガロースの表面に3つの1〜2ミリメートル幅のプラスチックチューブを置きます。
アガロースが固まったら、一対の鈍い鉗子を使用してチューブを取り除き、500マイクロリットルのオートクレーブ蒸留水で得られたインデントをカバーします。回収容器が準備ができたら、細かい自然なヘアペイントブラシを使用して、カブトムシの巣の場所から5つの8時間のT.marmoratus胚を、ステレオ顕微鏡の下でオートクレーブ蒸留水で満たされたガラスキャビティ皿に移します。顕微鏡と細かい解剖鉗子を使用して、両側から各胚の絨毛を把握し、胚が組織から穏やかにスライドすることを可能にする絨毛を開いて裂く。
収集されたすべての胚から両方の絨毛膜層を除去した後、慎重に準備されたアガロースプレートの溝にガラスキャビティ皿から胚を転送するために、絵筆を使用しています。遺伝子特異的な二本鎖RNAを初期段階の胚に注入するには、まずニードルプラーにマイクロインジェクションニードルを調製し、ステレオ顕微鏡を使用して鉗子を見つけて各先端を鋭い端に折ります。精製されたストックの目的の二本鎖RNAを氷の上に投げた後、得られた溶液に10X注入バッファーの1マイクロリットルを加え、二重蒸留水を使用して溶液のビニール体積を10マイクロリットルに持ち込みます。
P10ピペットを使用して、準備されたマイクロインジェクションニードルの1つを作業用の二本鎖RNA溶液で埋め戻し、圧力放出技術を利用するマイクロインジェクションシステムに接続されたマイクロニードルホルダーに針をロードします。マイクロインジェクションシステムと加圧空気供給をオンにし、マイクロインジェクションシステムのマイクロバルブを使用して、注入圧力を1平方インチあたり15ポンドの圧力に設定し、時間調整ノブを使用して注入時間を秒に設定します。注射針を較正するために、T.marmoratus胚用の空気中に注入する際に針の先端に形成される流体気泡の体積を評価するために、100〜200ミクロンの最適な気泡サイズを使用する。
注射針は、最適な気泡が約3秒の注入持続時間で平方インチあたり15ポンドの圧力で達成できるならば良質である。針をセットアップする準備ができたら、針が45〜60度の角度で胚に近づくような胚のアガロースプレートに針を整列させます。マイクロマニピュレータを使用して、先端が1つの胚の真ん中の表面に触れるまでマイクロニードルをゆっくりと動かし、針を慎重に前方に動かして、胚の表面を突き刺すだけです。
針が胚の中に入ったら、マイクロインジェクター注射ボタンを慎重に押して、二本鎖RNAの1〜2ナノリットルを胚に送り込みます。すべてのRNAが送達されると、胚が破裂することなく、胚から針をゆっくりと引き込みます。正常に注入された胚は、注射部位における着色スポットの存在によって同定することができる。
すべての胚が慎重に注入されたとき、14時間の明るい10時間の暗いサイクルに4〜5日間設定された摂氏25度のインキュベーターで、湿度室に皿を置きます。ステレオ顕微鏡で毎日胚の発達の進行を監視し、形態学的に目に見えるノックダウン型を特定します。高解像度のデジタル カメラを使用して開発プロセスを文書化する。
死んだ胚を取り除き、毎日アガロースプレートの水を補充して、潜伏期間中に他の生き残った胚への乾燥と微生物汚染の広がりを避けます。幼虫を採取する前に、まず60〜70度摂氏2%液体アガロースを小さなペトリ皿に加えます。アガロースが固まった場合、幼虫ごとに1つの浅いグループをアガロースに注入し、幼虫培養カップから静かに水を排出するために鈍い鉗子を使用します。
麻酔の後、柔らかいエンド鉗子を使用して、首と体が、アガロース表面の上に位置する尾と固定板に幼虫を慎重に置くために鉗子。すべての幼虫が配置されたとき、各溶岩を、まだ液体であるが危険なほど熱くないアガロースの厚い層で覆い、必要に応じて誤って覆われた物語を解放する。二本鎖RNAマイクロインジェクションのために、遺伝子特異的な二本鎖RNA作動溶液を有するマイクロニードルを、実証されたとおりにロードする。
手動で制御されたマイクロインジェクション注射器のプランジャーを再ドラッグし、マイクロインジェクションシステムに針をロードします。固定化された幼虫をステレオ顕微鏡の下に配置し、注射部位が比較的平坦な角度でマイクロ注射針の軌跡に合わせられる。マイクロマニピュレータを使用して、針先を幼虫に慎重に移動し、注射器にゆっくりと慎重に圧力をかけ、必要に応じて針内の着色注入液の動きに応じて注入圧力を調整します。
すべてのRNAが注入されると、柔らかい鉗子を使用してアガロースから幼虫を解放し、幼虫を室温水の新しい容器に25〜28度の摂氏25~28度、14時間の明るい10時間の暗いサイクルに入れます。この代表的な分析では、サンバーストダイビングカブトムシT.marmoratusのさまざまな異なる発達段階で3つの異なる遺伝子が倒されました。RNA干渉は、胚発生の非常に初期の段階で二本鎖RNAを注入することによって実証されるように行われる。
胚の一部は、プロセスを生き残り、壊死に変わります。これらの画像では、わずかに明るい目の色を持つ個人および個人を制御することが観察できる。この個体では、クラスターのより多くの腹側の嘘が完全に色素されていないがより深刻なノックダウンであるが、同盟国はまだいくつかの色素沈着を示すことができる。
ここでは、全眼において本質的に完全な顔料損失を有する別の個体の例が示されている。Lac2が幼虫で倒された場合、色素性のキューティクルが少なくなり、組織の異常な柔らかさのために翼がやや変形した軽い成人の個体も得られた。注入された動物を日常的に注意深く観察し、死んだ個体を直ちに取り除くことを強く見てください。
この技術の力は、多くの異なる生物の遺伝子に適用することができることである。この技術は、進化進化生物学にも広く、またうまく応用されています。
