Selv om genredigering har blitt populært for å studere molekylær genetikk av ikke-modellorganismer, er RNAi fortsatt et kraftig synergistisk verktøy. Den største fordelen med denne teknikken er at den kan brukes på forskjellige utviklingsstadier. I tillegg kan delvis knockdown brukes til å studere hele genene.
Suksessen til prosedyren er avhengig av injeksjon av DSR og har minimal skade. Dette krever praksis, så ikke bli motløs hvis det tar noen forsøk på å få det riktig. For å forberede tidlige stadium embryoer for mikro injeksjon, først helle kokende 20% agarose i en liten petriskål og plassere tre en til to millimeter brede plastrør på overflaten av væsken oppsto før den stivner.
Når agarose har størknet bruke et par stumpe tang for å fjerne rørene og dekke de resulterende innrykkene med 500 mikroliter autoklav destillert vann. Når oppsamlingsbeholderen er klar, bruk en fin naturlig hårmalingsbørste til å overføre fem åtte timers gamle T.marmoratus embryo fra bille hekkende steder til et glass hulromsrett fylt med autoklav destillert vann under et stereomikroskop. Ved hjelp av mikroskopet og fine disseksjonskrafter griper chorion av hvert embryo fra begge sider og chorion åpen slik at embryoet kan gli forsiktig ut av vevet.
Etter å ha fjernet begge chorion lag fra alle de oppsamlede embryoer bruke pensel til å forsiktig overføre embryoer fra glasshulen parabolen inn i sporene av forberedt agarose plate. For å injisere tidlige embryoer med genspesifikke dobbelttrådet RNA først forberede mikroinjeksjon nåler på en nål og bruke stereomikroskopet og finne tang for å bryte hver spiss til en skarp kant. Etter å ha kastet den rensede bestanden dobbelttrådet RNA av interesse på is, tilsett en mikroliter 10X injeksjonsbuffer til den resulterende løsningen og bruk dobbelt destillert vann for å bringe vinylvolumet av løsningen til 10 mikroliter.
Bruk en P10-pipette til å etterfylle en av de tilberedte mikroinjeksjonsnålene med den fungerende dobbelttrådet RNA-løsningen og last nålen inn i en mikronåleholder som er koblet til et mikroinjeksjonssystem som benytter trykkutstøtingsteknologi. Slå på mikroinjeksjonssystemet og trykklufttilførselen og bruk mikroventilen på mikroinjeksjonssystemet til å sette injeksjonstrykket til 15 pounds trykk per kvadrattomme, og bruk deretter tidsjusteringsknappen til å stille injeksjonsvarigheten til sekunder. For å kalibrere injeksjonsnålen, bør du vurdere volumet av væskeboblen som dannes på spissen av nålen når den injiseres i luft for T.marmoratus embryo, bruk en optimal boblestørrelse på 100 til 200 mikron.
Injeksjonsnålen er av god kvalitet hvis optimale bobler kan oppnås ved 15 pounds av trykk per kvadrattomme med en injeksjonsvarighet på ca tre sekunder. Når nålen satt opp er klar justere nålen på agarose plate av embryoer slik at nålen nærmer embryoene i en 45 til 60 graders vinkel. Bruk mikromanipulatoren til å sakte flytte mikronålen til spissen berører overflaten av midten av ett embryo og beveger deretter forsiktig nålen fremover til den bare pierces overflaten av embryoet.
Når nålen er inne i embryoet trykk forsiktig på injeksjonsknappen for mikroinjektor for å levere en til to nanoliter med dobbelt strandet RNA inn i embryoet. Når hele RNA har blitt levert sakte trekke nålen fra embryoet uten å få embryoet til å briste. Vellykket injisert embryoer kan identifiseres ved tilstedeværelse av et farget sted på injeksjonsstedet.
Når alle embryoene har blitt injisert nøye plassere parabolen i et fuktighetskammer i en 25 grader Celsius inkubator satt til en 14 timers lys 10 timers mørk syklus i fire til fem dager. Overvåk embryoutviklingsfremgangen daglig under stereomikroskopet for å identifisere morfologisk synlige knockdown fenotyper. Bruke et høyoppløselig digitalkamera til å dokumentere utviklingsprosessen.
Fjern eventuelle døde embryoer og etterfyll vannet på agaroseplaten daglig for å unngå uticcation og spredning av mikrobiell forurensning til andre overlevende embryoer i inkubasjonsperioden. Før du samler larven først legge 60 til 70 grader Celsius 2% væske agarose til en liten petriskål. Når agarose har størknet bruke stump tang for å gjøre en grunn gruppe per larve som skal injiseres i agarose og forsiktig drenere vannet fra larve kultur kopper.
Etter anestesi bruk myke endt tang for å forsiktig plassere larven på immobiliseringsplaten med nakker og kropper i sporene, men halen som ligger over agaroseoverflaten. Når hele larven hadde blitt plassert, dekk hver lava med et tykt lag av agarose som fortsatt er flytende, men ikke farlig varmt og gratis noen historier som ved et uhell ble dekket etter behov. for en dobbel strandet RNA mikroinjeksjon laste et mikroneedle med genspesifikk dobbelt strandet RNA arbeidsløsning av interesse som demonstrert.
Avdrag stempelet på en manuelt kontrollert mikroinjeksjonssprøyte og legg kanylen på mikroinjeksjonssystemet. Plasser den immobiliserte larven under stereomikroskopet slik at injeksjonsstedet er på linje med banen til mikroinjeksjonsnålen i en relativt flat vinkel. Bruk mikromanipulatoren til å forsiktig flytte nålespissen inn i larven og sakte og forsiktig legge press på sprøyten, justere injeksjonstrykket i henhold til bevegelsen av den fargede injeksjonsvæsken i nålen etter behov.
Når alle RNA har blitt injisert bruke myke tang for å frigjøre larven fra agarose og plassere larven i en ny beholder med romtemperatur vann på 25 til 28 grader Celsius og en 14 timers lys 10 timers mørk syklus. I denne representative analysen ble tre forskjellige gener slått ned på en rekke ulike utviklingsstadier av den solbelastede dykkerboblen T.marmoratus. RNA interferens utføres som vist ved å injisere dobbelttrådet RNA på et svært tidlig stadium av embryogenese.
Noen av embryoene overlever ikke prosessen og blir nekrotisk. I disse bildene kontrollerer de individet og en person med litt lysere øyenfarge kan observeres. I denne personen, en mer alvorlig knockdown der de mer ventrale løgnene i klyngen er helt uovertraktet, men gjør allierte viser fortsatt noen pigmentering kan observeres.
Her vises et eksempel på et annet individ med i hovedsak fullstendig pigmenttap i alle øynene. Lac2 slått ned i larver resulterer i en mindre pigmentert skjellaget, lettere voksne individer med noe deformerte vinger sannsynligvis på grunn av den uvanlige mykhet av vevet ble også oppnådd. Sørg for å se ivrig å nøye observere injiserte dyr på daglig basis og umiddelbart fjerne eventuelle døde personer.
Kraften i denne teknikken er at den kan brukes på genene til mange forskjellige organismer. Denne teknikken har også blitt mye og vellykket brukt på evolusjonær utviklingsbiologi.