Även som genredigering har blivit populär för att studera molekylär genetik av icke-modell organismer, RNAi är fortfarande ett kraftfullt synergistiska verktyg. Den största fördelen med denna teknik är att den kan tillämpas på olika utvecklingsstadier. Dessutom kan partiell nedslagning användas för att studera dessa hela gener.
Framgången för förfarandet bygger på injektion av DSR och har minimal skada. Detta tar praxis, så bli inte avskräckt om det tar några försök att få det rätt. För att förbereda tidigt stadium embryon för mikroinjektion, först häll kokande 20%agarose i en liten Petriskål och placera tre en till två millimeter breda plaströr på ytan av vätskan agarrose innan den stelnar.
När agaros har stelnat använda ett par trubbiga tlyck för att ta bort rören och täcka de resulterande inbuktningar med 500 mikroliter av autoklav destillerat vatten. När uppsamlingsbehållaren är klar använder en fin naturlig hårfärgspensel för att överföra fem åtta timmar gamla T.marmoratusembryo från skalbaggens häckningsplatser till en glashålaskål fylld med autoklavdestillerat vatten under ett stereomikroskop. Med hjälp av mikroskop och fina dissektionstångar greppa chorion av varje embryo från båda sidor och rippa chorion öppna så att embryot att glida försiktigt ut ur vävnaden.
Efter att ha tagit bort båda chorionskikten från alla de insamlade embryona använder penseln för att noggrant överföra embryona från glashålighetsfatet i spåren på den beredda agarosplattan. Att injicera tidigt stadium embryon med genen specifika dubbel strandade RNA först förbereda microinjection nålar på en nål puler och använda stereo mikroskop och hitta tärningar för att bryta varje spets till en skarp kant. Efter att ha kastat den renade lager dubbelsträngade RNA av intresse på is, tillsätt en mikroliter av 10X injektion buffert till den resulterande lösningen och använda dubbel destillerat vatten för att få vinylvolymen av lösningen till 10 mikroliter.
Använd en P10-pipett för att fylla på en av de förberedda mikroinjektionsnålarna med den fungerande dubbelsträngade RNA-lösningen och ladda nålen till en mikronålshållare som är ansluten till ett mikroinjektionssystem som utnyttjar tryckutmatningsteknik. Slå på microinjection systemet och den trycksatta lufttillförseln och använda mikroventilen på microinjection systemet för att ställa in insprutningstrycket till 15 pounds av tryck per kvadrattum sedan använda tidsjustering ratten för att ställa in injektionen varaktighet till sekunder. För att kalibrera injektionsnålen bedöma volymen av fluidbubblan som bildas vid nålspetsen vid injicering i luft för T.marmoratus embryo använd en optimal bubbelstorlek på 100 till 200 mikrometer.
Injektionen nålen är av god kvalitet om optimala bubblor kan uppnås vid 15 pounds av tryck per kvadrattum med en injektion varaktighet på cirka tre sekunder. När nålen inrättas är redo rikta nålen på agarosplattan av embryon så att nålen närmar sig embryona i en 45 till 60 graders vinkel. Använd mikro manipulatorn för att långsamt flytta mikronålen tills spetsen vidrör ytan av mitten av ett embryo sedan försiktigt flytta nålen framåt tills den bara genomborrar ytan av embryot.
När nålen är inne i embryot försiktigt trycka på mikro injektor injektionsknappen för att leverera en till två nanoliter av dubbelsträngat RNA i embryot. När alla RNA har levererats långsamt dra tillbaka nålen från embryot utan att embryot att brista. Framgångsrikt injicerade embryon kan identifieras genom närvaron av en färgad plats vid injektionsstället.
När alla embryon har injicerats försiktigt placera skålen i en luftfuktighet kammare i en 25 grader Celsius inkubator inställd på en 14 timmars ljus 10 timmars mörk cykel i fyra till fem dagar. Övervaka embryot utvecklingen framsteg dagligen under stereo mikroskop för att identifiera morfologiskt synliga knockdown fenotyper. Med hjälp av en digitalkamera med hög upplösning för att dokumentera utvecklingsprocessen.
Avlägsna eventuella döda embryon och fyll på vattnet på agarosplattan dagligen för att undvika uttorkning och spridning av mikrobiell kontaminering till andra överlevande embryon under inkubationstiden. Innan du samlar larven först tillsätt 60 till 70 grader Celsius 2%vätska agaros till en liten Petriskål. När agaros har stelnat använda trubbiga tensor för att göra en grund grupp per larva som ska injiceras i agaros och försiktigt dränera vattnet från larva kultur koppar.
Efter anestesi använda mjuka slutade tlyckor för att försiktigt placera larven på immobilisering plattan med halsar och kroppar i spåren men svansen ligger ovanför agaros yta. När alla larven hade placerats, täck varje lava med ett tjockt lager av agarose som fortfarande är flytande men inte farligt varmt och fria alla berättelser som av misstag täcktes vid behov. för en dubbel strandade RNA microinjection belastning en microneedle med genen specifika dubbel strandade RNA arbetslösning av intresse som visats.
Redrag kolven av en manuellt kontrollerad mikroinjektionsspruta och ladda nålen på mikroinjektionssystemet. Placera den immobiliserade larven under stereomikroskopet så att injektionsstället är i linje med mikroinjektionsnålens bana i relativt plan vinkel. Använd mikromanipulatorn för att försiktigt föra nålspetsen in i larven och långsamt och försiktigt applicera tryck på sprutan, justera injektionstrycket enligt den färgade injektionsvätskans rörelse i nålen vid behov.
När alla av RNA har injicerats använda mjuka tlyck för att frigöra larven från agaros och placera larven i en ny behållare med rumstemperatur vatten vid 25 till 28 grader Celsius och en 14 timmars ljus 10 timmars mörk cykel. I denna representativa analys tre olika gener slogs ner på en mängd olika utvecklingsstadier av sunburst dykning skalbagge T.marmoratus. RNA-interferens utförs som visats genom att man injicerar dubbelsträngat RNA i ett mycket tidigt stadium av embryogenes.
Några av embryona överlever inte processen och blir nekrotiska. I dessa bilder de styr enskilda och en individ med en något ljusare ögonfärg kan observeras. I denna individ, en mer allvarlig knockdown där de mer ventrala lögner av klustret är helt unpigmented men gör allierade visar fortfarande vissa pigmentering kan observeras.
Här visas ett exempel på en annan individ med i huvudsak fullständig pigmentförlust i alla ögon. Lac2 knackade ner i larver resulterar i en mindre pigmenterad nagelband, lättare vuxna individer med något deformerade vingar sannolikt på grund av den ovanliga mjukhet av vävnaden erhölls också. Var noga med att titta ivrigt att noga observera dina injicerade djur på en daglig basis och att omedelbart ta bort eventuella döda individer.
Kraften i denna teknik är att den kan appliceras på generna hos många olika organismer. Denna teknik har också allmänt och framgångsrikt tillämpats på evolutionär utvecklingsbiologi.