هذا البروتوكول كمي تدفقات الكالسيوم في الخلايا العصبية الدوبامين, التي تضيع في مرض باركنسون. وهذا مفيد لفهم كيف يسبب الكالسيوم غير طبيعي فقدان الخلايا العصبية الدوبامين في مرض باركنسون. لأول مرة، نبرهن على تدفق الكالسيوم العفوي في الخلايا العصبية المتوسطة الأولية المستزرعة.
يمكن استخدام هذه الطريقة لتشريح مساهمات مستقبلات محددة تشارك في موت الخلايا المبرمج بوساطة الكالسيوم. يوفر طريقتنا وسيلة لشاشات الأدوية عالية المحتوى لاكتشاف مركبات حماية عصبية محددة وفعالة لمرض باركنسون. هذه المركبات العصبية منع المبرمج بوساطة الكالسيوم في الخلايا العصبية الدوبامين.
تبدأ من خلال إعداد ملليلتر واحد من مصل الدم الخالية من المتوسط مع ميكرولتر واحد من hSyn-GCaMP6f AAV لكل طبق. استلهمي متوسطة ثقافة الخلية من كل طبق واستبدله بميليلتر واحد من DMEM المعدة مع hSyn-GCaMP6f. ضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد الحضانة، وpirate المتوسطة مع AAVs واستبدالها مع ثلاثة ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة. احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية لمدة خمسة إلى سبعة أيام. تغيير المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام طوال هذه الفترة من العدوى الفيروسية.
إعداد لتر واحد من العازلة تسجيل HEPES، 200 ملليلتر من 20 غلوتامات micromolar تسجيل العازلة، و 200 ملليلتر من 10 مخزن تسجيل NBQX ميكرومولار وفقا لاتجاهات المخطوطات. ملء طبق معقمة 35 ملليمتر Petri مع ثلاثة ملليلتر من العازلة تسجيل. خذ طبق بيتري مع الثقافات المصابة من الحاضنة ، ثم أمسك بعناية حافة زلة غطاء واحد مع ملقط تلميح ناعم ونقله إلى الطبق مع المخزن المؤقت للتسجيل.
ضع زلة الغطاء المتبقية في وسط الظهر إلى حاضنة 37 درجة مئوية ونقل الطبق مع عازلة التسجيل إلى المجهر confocal. بدء تشغيل برنامج التصوير. أثناء تهيئة، بدء مضخة ال peristaltic ووضع الخط في المخزن المؤقت التسجيل.
ثم معايرة تدفق إلى مليلترين في الدقيقة الواحدة. نقل زلة الغطاء المصابة من طبق بيتري إلى حمام التسجيل مع ملقط غرامة. باستخدام الهدف 10X غمر الماء والضوء brightfield، والعثور على الطائرة من التركيز والبحث عن منطقة ذات كثافة عالية من الأجسام خلية الخلايا العصبية، ثم التبديل إلى الهدف 40X وإعادة تركيز العينة.
حدد تطبيق AlexaFluor 488 في إطار قائمة الأصباغ. من أجل منع التعرض المفرط وتبييض الصور من الفلوروفوريس، تبدأ مع إعدادات الطاقة HV والليزر منخفضة. بالنسبة لقناة AlexaFluor 488، قم بتعيين HV إلى 500، والمكسب إلى 1x، والأزاحة إلى صفر.
تعيين السلطة إلى 5٪ لخط الليزر 488. قم بزيادة حجم الثقب إلى 300 ميكرومتر واستخدم خيار المسح البؤري x2 لضبط إشارات الانبعاثات على النحو الأمثل مع مستويات التشبع دون المشبعة. ويمكن ضبط الإعدادات بعد ذلك من أجل الرؤية المثلى لكل قناة.
بمجرد تحسين إعدادات المجهر، قم بتحريك المرحلة لتحديد موقع منطقة مع خلايا متعددة تعرض تغييرات تلقائية في الفلوري GCaMP6f والتركيز على المستوى المطلوب للتصوير. استخدم أداة المقطع المقطع لقص إطار التصوير إلى حجم يمكن أن يحقق فاصل إطار أقل من ثانية واحدة فقط. تعيين إطار الفاصل الزمني إلى قيمة 1.0 و إطار Num إلى 600.
لالتقاط فيلم من سلسلة t، حدد خيار الوقت، ثم استخدم خيار المسح الضوئي Xyt لبدء التصوير. شاهد شريط تقدم التصوير وحرك الخط من مخزن تسجيل HEPES إلى مخزن تسجيل الغلوتامات الـ 20 ميكرومولار عند النقطة الزمنية المناسبة. عند اكتمال التصوير، حدد الزر "تم" في السلسلة واحفظ الفيلم النهائي من السلسلة t.
الاستمرار في ضخ الغلوتامات لمدة خمس دقائق إضافية بحيث تعرضت لثقافة الخلايا العصبية للغلوتامات لما مجموعه 10 دقائق. كرر هذه العملية لكل قسيمة أغطية ليتم تصويرها. فمن الممكن لعرض آثار الكالسيوم والهيئات الخلايا العصبية مباشرة بعد التجربة.
استخدام أداة القطع الناقص لرسم العدد المطلوب من ROIs حول سوما العصبية. واستخدم زر تحليل السلسلة لتصور الآثار. بعد التعرض لمدة خمس دقائق إضافية للغلوتامات، قم بإزالة زلة الغطاء من الحمام باستخدام ملقط ناعم وضعه مرة أخرى في طبق بيتري مع المخزن المؤقت للتسجيل حتى يتم الانتهاء من جميع الصور.
في يوم التصوير، تم التعامل مع الثقافات VM إما مع الغلوتامات أو مزيج من الغلوتامات و NBQX. في كلتا الحالتين، لوحظت تغيرات غير متجانسة وتلقائية في الفلوركات GCaMP6f تشير إلى تدفقات الكالسيوم العفوية. تطبيق الغلوتامات ولدت استجابة قوية ومستدامة الكالسيوم في كل من الخلايا العصبية النشطة بشكل عفوي وsedscent.
تطبيق NBQX خفض النشاط التلقائي، وعرقلة جزئيا استجابة الغلوتامات. تم قياس مدى تحفيز تطبيق الغلوتامات استجابة الكالسيوم في كل حالة كمياً باستخدام المساحة تحت المنحنى، ومساحة الذروة، والكمون للاستجابة. ازداد الكمون إلى الاستجابة في ظل حالة NBQX والغلوتامات.
لقياس المبرمج الغلوتامي بوساطة الغلوتامات ، تم إصلاح الخلايا والملطخة باجسام مضادة لـ Caspase-3. وكان متوسط كثافة caspase-3 أعلى بكثير في كل من ظروف العلاج مقارنة بالضوابط غير المعالجة. ويمكن إجراء تحليل أكثر شمولا للوفاة بالخلايا السامة متحمس من خلال عد عدد من المناعي التيروزين هيدروكسيلاس الخلايا العصبية الدوبامين الإيجابية في السيطرة والغلوتامات علاج حالة.
وقد مهدت هذه التقنية الطريق لفهم المساهمات النسبية من مستقبلات مختلفة وقنوات الحديد المشاركة في المبرمج بالكالسيوم بوساطة في الخلايا العصبية الدوبامين.
