Denne protokol kvantificerer calcium fluxes i dopaminerge neuroner, som er tabt i Parkinsons sygdom. Dette er nyttigt for at forstå, hvordan unormal calcium forårsager dopaminerge neuron tab i Parkinsons sygdom. For første gang demonstrerer vi spontane calciumflukser i dyrkede primære midbrain neuroner.
Denne metode kan bruges til at dissekere specifikke receptor bidrag involveret i calcium-medieret apoptose. Vores metode giver en vej til højt indhold narkotika skærme til at opdage specifikke og effektive neuroprotektive forbindelser til Parkinsons sygdom. Disse neuroprotektive forbindelser ville forhindre calcium-medieret apoptose i dopaminerge neuron.
Begynd med at forberede en milliliter serumfri DMEM-medium med en mikroliter hSyn-GCaMP6f AAV pr. skål. Aspirere cellekulturmediet fra hver skål og udskift det med en milliliter af det forberedte DMEM med hSyn-GCaMP6f. Placer retterne tilbage i 37 grader Celsius inkubator i en time.
Efter inkubationen, aspirere mediet med AAVs og erstatte det med tre milliliter cellekultur medium. Inkuber retterne ved 37 grader Celsius i fem til syv dage. Ændring af mediet hver to til tre dage i hele denne periode af virusinfektion.
Forbered en liter af HEPES optagelse buffer, 200 milliliter af 20 mikromolar glutamat optagelse buffer, og 200 milliliter 10 mikromolar NBQX optagelse buffer i henhold til manuskript retninger. Fyld en steril 35 millimeter petriskål med tre milliliter af optagelsesbufferen. Tag petriskålen med de inficerede kulturer fra kuvøsen, og grib forsigtigt kanten af en dæksel slip med fine spidsforrævnte og overfør den ind i skålen med optagelsesbufferen.
Placer den resterende dæksel slip i medium tilbage i 37 grader Celsius inkubator og transport skålen med optagelse buffer til konfokale mikroskop. Start billedbehandlingssoftwaren. Mens det er initialisering, skal du starte peristaltiske pumpe og placere linjen i optagelsen buffer.
Kalibrer derefter strømmen til to milliliter i minuttet. Overfør den inficerede dæksel slip fra Petriskålen til optagelsesbadet med fine scecet. Brug 10X vand nedsænkning mål og brightfield lys, finde planet fokus og kigge efter en region med en høj tæthed af neuron celle organer, derefter skifte til 40X mål og refokusering prøven.
Vælg og anvend AlexaFluor 488 i listevinduet Farvestoffer. For at forhindre overeksponering og foto blegning af fluorophores, start med lav HV og laser magt indstillinger. For AlexaFluor 488-kanalen skal du indstille HV til 500, gevinsten til 1x og forskydningen til nul.
Indstil strømmen til 5% for 488 laserlinje. Forøg pinhole-størrelsen til 300 mikrometer, og brug indstillingen fokus x2-scanning til at justere emissionssignalerne optimalt til undermætningsniveauer. Indstillingerne kan derefter justeres for optimal synlighed af hver kanal.
Når mikroskopindstillingerne er optimeret, skal du flytte scenen for at finde et område med flere celler, der viser spontane ændringer i GCaMP6f-fluorescens, og fokuser på det ønskede plan til billedbehandling. Brug værktøjet Klip rekt til at klippe billedrammen til en størrelse, der kan opnå et rammeinterval på knap et sekund. Angiv intervalvinduet til en værdi på 1,0 og vinduet Num til 600.
Hvis du vil hente en film i t-serien, skal du vælge indstillingen Tid og derefter bruge indstillingen Xyt-scanning til at starte billedbehandling. Se statuslinjen for billeddiagnostiske billeder, og flyt linjen fra HEPES-optagelsesbufferen til den 20 mikromolarglaktamaer, der registrerer bufferen på det relevante tidspunkt. Når billedbehandling er fuldført, skal du vælge knappen Færdig med serien og gemme den færdige film i t-serien.
Fortsæt med at gennemgå glutamat i yderligere fem minutter, således at kulturen af neuroner har været udsat for glutamat i alt 10 minutter. Gentag denne proces for hver følgeseddel, der skal afbildes. Det er muligt at se calciumspor og neuronalcellekroppe umiddelbart efter eksperimentet.
Brug ellipseværktøjet til at tegne det ønskede antal ROI'er omkring neuronal soma. Og brug knappen Serieanalyse til at visualisere sporene. Efter yderligere fem minutters udsættelse for glutamat fjernes dækslet fra badet med fine scefæcef og sættes tilbage i petriskålen med optagelsesbufferen, indtil al billeddannelse er afsluttet.
På billeddagen blev VM-kulturerne behandlet med enten glutamat eller en kombination af glutamat og NBQX. Under begge forhold blev der observeret heterogene og spontane ændringer i GCaMP6f florescens, hvilket indikerer spontane calciumfug. Anvendelse af glutamat genereret en robust og vedvarende calcium respons i både spontant aktive og quiescent neuroner.
Anvendelse af NBQX reducerede spontan aktivitet og blokerede delvist glutamatresponset. I hvilket omfang glutamatapplikationen stimulerede et calciumrespons i hver tilstand, blev kvantificeret ved hjælp af området under kurven, peak amplitude og ventetid til at reagere. Ventetiden til respons steg under NBQX og glutamat tilstand.
For at måle glutamat-medieret apoptose, cellerne blev fastsat og farves med en anti-Caspase-3 antistof. Gennemsnitlig caspase-3 intensitet var signifikant højere i begge behandlingsbetingelser sammenlignet med ubehandlede kontroller. En mere grundig analyse af ophidset giftige celledød kan gøres ved at tælle antallet af immunostain tyrosin hydroxylase positive dopaminerge neuroner i kontrol og glutamat behandlet tilstand.
Denne teknik har banet vejen for at forstå de relative bidrag fra forskellige receptorer og jernkanaler involveret i calcium-medieret apoptose i dopaminerge neuron.
