प्राथमिक माउस मिडब्रेन न्यूरॉन्स में सहज Ca^{2 +} फ्लक्स और उनके डाउनस्ट्रीम प्रभावों की मात्रा निर्धारित करना

यह प्रोटोकॉल डोपमिनेर्गिक न्यूरॉन्स में कैल्शियम फ्लक्स की मात्रा को निर्धारित करता है, जो पार्किंसंस रोग में खो जाते हैं। यह समझने के लिए उपयोगी है कि असामान्य कैल्शियम पार्किंसंस रोग में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन हानि का कारण बनता है। पहली बार, हम सुसंस्कृत प्राथमिक मिडब्रेन न्यूरॉन्स में सहज कैल्शियम प्रवाह प्रदर्शित करते हैं।

इस विधि का उपयोग कैल्शियम-मध्यस्थता एपोप्टोसिस में शामिल विशिष्ट रिसेप्टर योगदान को विच्छेदन करने के लिए किया जा सकता है। हमारी विधि पार्किंसंस रोग के लिए विशिष्ट और प्रभावी न्यूरोप्रोटेक्टिव यौगिकों की खोज करने के लिए उच्च सामग्री दवा स्क्रीन के लिए एक अवसर प्रदान करती है। ये न्यूरोप्रोटेक्टिव यौगिक डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन में कैल्शियम-मध्यस्थता एपोप्टोसिस को रोकेंगे।

प्रति डिश एचएसएन-GCaMP6f AAV के एक माइक्रोलीटर के साथ सीरम-मुक्त डीएमईएम माध्यम का एक मिलीलीटर तैयार करके शुरू करें। प्रत्येक डिश से सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे तैयार डीएमईएम के एक मिलीलीटर के साथ HSyn-GCaMP6f के साथ प्रतिस्थापित करें। व्यंजनों को एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रखें।

इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को एएवी के साथ एस्पिरेट करें और इसे सेल कल्चर माध्यम के तीन मिलीलीटर के साथ बदलें। पांच से सात दिनों तक व्यंजनों को ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । वायरल इंफेक्शन की इस अवधि में हर दो से तीन दिन में माध्यम बदलना।

हेपेस रिकॉर्डिंग बफर का एक लीटर, 20 माइक्रोमोलर ग्लूटामेट रिकॉर्डिंग बफर के 200 मिलीलीटर, और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार 10 माइक्रोमोलर एनबीक्यूएक्स रिकॉर्डिंग बफर के 200 मिलीलीटर तैयार करें। रिकॉर्डिंग बफर के तीन मिलीलीटर के साथ एक बाँझ 35 मिलीमीटर पेट्री डिश भरें। इनक्यूबेटर से संक्रमित संस्कृतियों के साथ पेट्री डिश लें, फिर ध्यान से ठीक टिप संदंश के साथ एक कवर स्लिप के किनारे को पकड़ें और इसे रिकॉर्डिंग बफर के साथ डिश में स्थानांतरित करें।

शेष कवर पर्ची को मध्यम पीठ में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और कंफोकल माइक्रोस्कोप में बफर रिकॉर्डिंग के साथ पकवान का परिवहन करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करें। जबकि यह शुरू हो रहा है, पेरिस्टाल्टिक पंप शुरू करें और लाइन को रिकॉर्डिंग बफर में रखें।

फिर प्रति मिनट दो मिलीलीटर के लिए प्रवाह को जांचना। संक्रमित कवर स्लिप को पेट्री डिश से बारीक संदंश के साथ रिकॉर्डिंग बाथ में स्थानांतरित करें। 10X पानी विसर्जन उद्देश्य और ब्राइटफील्ड प्रकाश का उपयोग करना, ध्यान के विमान को खोजें और न्यूरॉन सेल निकायों के उच्च घनत्व वाले क्षेत्र की तलाश करें, फिर 40X उद्देश्य पर स्विच करें और नमूने को फिर से केंद्रित करें।

रंगों की सूची विंडो में एलेक्साफ्लूर 488 का चयन करें और लागू करें। फ्लोरोफोरस के ओवरएक्सपोजर और फोटो ब्लीचिंग को रोकने के लिए, कम एचवी और लेजर पावर सेटिंग्स के साथ शुरू करें। एलेक्साफ्लूर 488 चैनल के लिए, एचवी को 500 सेट करें, 1x का लाभ, और ऑफसेट शून्य हो गया।

488 लेजर लाइन के लिए 5% करने के लिए बिजली निर्धारित करें। पिनहोल के आकार को 300 माइक्रोमीटर तक बढ़ाएं और उत्सर्जन संकेतों को सबसैचुरेशन स्तर पर बेहतर ढंग से समायोजित करने के लिए फोकस x2 स्कैनिंग विकल्प का उपयोग करें। इसके बाद सेटिंग्स को प्रत्येक चैनल की इष्टतम दृश्यता के लिए समायोजित किया जा सकता है।

एक बार माइक्रोस्कोप सेटिंग्स अनुकूलित कर रहे हैं, GCaMP6f फ्लोरेसेंस में सहज परिवर्तन प्रदर्शित कई कोशिकाओं के साथ एक क्षेत्र का पता लगाने के लिए मंच ले जाएँ और इमेजिंग के लिए वांछित विमान पर ध्यान केंद्रित। इमेजिंग फ्रेम को एक आकार में क्लिप करने के लिए क्लिप रेक्ट टूल का उपयोग करें जो एक सेकंड के नीचे के फ्रेम अंतराल को प्राप्त कर सकता है। इंटरवल विंडो को 1.0 और एनयूएम विंडो को 600 के मूल्य पर सेट करें।

एक टी-सीरीज फिल्म पर कब्जा करने के लिए, समय विकल्प का चयन करें, फिर इमेजिंग शुरू करने के लिए जायट स्कैनिंग विकल्प का उपयोग करें। इमेजिंग प्रगति बार देखें और उचित समय बिंदु पर 20 माइक्रोमोलर ग्लूटामेट रिकॉर्डिंग बफर में हेप्स रिकॉर्डिंग बफर से लाइन को स्थानांतरित करें। इमेजिंग पूरी होने पर, श्रृंखला किए गए बटन का चयन करें और तैयार टी-सीरीज फिल्म को सहेजें।

अतिरिक्त पांच मिनट के लिए ग्लूटामेट को छिद्रित करना जारी रखें ताकि न्यूरॉन्स की संस्कृति कुल 10 मिनट के लिए ग्लूटामेट के संपर्क में आ जाए। प्रत्येक कवर स्लिप को इमेज करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। प्रयोग के तुरंत बाद कैल्शियम के निशान और न्यूरोनल सेल निकायों को देखना संभव है।

न्यूरोनल सोमा के आसपास आरओआई की वांछित संख्या आकर्षित करने के लिए एलिप्से उपकरण का उपयोग करें। और निशान की कल्पना करने के लिए श्रृंखला विश्लेषण बटन का उपयोग करें। ग्लूटामेट के अतिरिक्त पांच मिनट के एक्सपोजर के बाद, ठीक संदंश के साथ स्नान से कवर स्लिप को हटा दें और इसे रिकॉर्डिंग बफर के साथ पेट्री डिश में वापस रखें जब तक कि सभी इमेजिंग पूरी न हो जाए।

इमेजिंग के दिन, वीएम संस्कृतियों को या तो ग्लूटामेट या ग्लूटामेट और एनबीक्यूएक्स के संयोजन के साथ इलाज किया गया था। दोनों ही स्थितियों में, GCaMP6f फ्लोरेसेंस में विषम और सहज परिवर्तन सहज कैल्शियम प्रवाह का संकेत मनाया गया । ग्लूटामेट के आवेदन ने अनायास सक्रिय और शांत दोनों न्यूरॉन्स में एक मजबूत और निरंतर कैल्शियम प्रतिक्रिया उत्पन्न की।

NBQX के आवेदन ने सहज गतिविधि को कम किया, और ग्लूटामेट प्रतिक्रिया को आंशिक रूप से अवरुद्ध कर दिया। जिस हद तक ग्लूटामेट आवेदन ने प्रत्येक स्थिति में कैल्शियम प्रतिक्रिया को प्रेरित किया था, वक्र, पीक आयाम और जवाब देने के लिए विलंबता के तहत क्षेत्र का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया गया था। प्रतिक्रिया के लिए विलंबता NBQX और ग्लूटामेट स्थिति के तहत वृद्धि हुई ।

ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस को मापने के लिए, कोशिकाओं को एक एंटी-कैस्पास-3 एंटीबॉडी के साथ तय किया गया था और दाग दिया गया था। मतलब caspase-3 तीव्रता अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में दोनों उपचार की स्थिति में काफी अधिक था । उत्तेजित विषाक्त कोशिका मृत्यु का अधिक गहन विश्लेषण नियंत्रण और ग्लूटामेट उपचारित स्थिति में इम्यूनोदात टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज पॉजिटिव डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स की संख्या की गिनती करके किया जा सकता है।

इस तकनीक ने डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन में कैल्शियम-मध्यस्थता एपोप्टोसिस में शामिल विभिन्न रिसेप्टर्स और लोहे के चैनलों के सापेक्ष योगदान को समझने का मार्ग प्रशस्त किया है।