Este protocolo quantifica os fluxos de cálcio em neurônios dopaminérgicos, que são perdidos na doença de Parkinson. Isso é útil para entender como o cálcio anormal causa a perda de neurônios dopaminérgicos na doença de Parkinson. Pela primeira vez, demonstramos fluxos espontâneos de cálcio em neurônios primários de cérebro médio cultivados.
Este método pode ser usado para dissecar contribuições específicas de receptores envolvidos na apoptose mediada pelo cálcio. Nosso método fornece um caminho para telas de drogas de alto conteúdo para descobrir compostos neuroprotetores específicos e eficazes para a doença de Parkinson. Esses compostos neuroprotetores evitariam apoptose mediada por cálcio em neurônios dopaminérgicos.
Comece preparando um mililitro de meio DMEM sem soro com um microliter de hSyn-GCaMP6f AAV por prato. Aspire o meio de cultura celular de cada prato e substitua-o por um mililitro do DMEM preparado com hSyn-GCaMP6f. Coloque os pratos de volta na incubadora Celsius de 37 graus por uma hora.
Após a incubação, aspire o meio com AAVs e substitua-o por três mililitros de meio de cultura celular. Incubar os pratos a 37 graus Celsius por cinco a sete dias. Mudando o meio a cada dois ou três dias durante esse período de infecção viral.
Prepare um litro do buffer de gravação hepes, 200 mililitros de 20 tampão de gravação de glutamato micromolar e 200 mililitros de 10 tampão de gravação micromolar NBQX de acordo com as instruções do manuscrito. Encha uma placa de Petri estéril de 35 milímetros com três mililitros do tampão de gravação. Pegue a placa de Petri com as culturas infectadas da incubadora, em seguida, pegue cuidadosamente a borda de um deslizamento de cobertura com fórceps finos de ponta e transfira-o para o prato com o tampão de gravação.
Coloque o deslizamento de cobertura restante em médio de volta para a incubadora de 37 graus Celsius e transporte o prato com tampão de gravação para o microscópio confocal. Inicie o software de imagem. Enquanto estiver inicializando, inicie a bomba peristáltica e coloque a linha no buffer de gravação.
Em seguida, calibrar o fluxo para dois mililitros por minuto. Transfira o deslizamento de cobertura infectado da placa de Petri para o banho de gravação com fórceps finos. Usando o objetivo de imersão de água 10X e luz de campo brilhante, encontre o plano de foco e procure uma região com alta densidade de corpos celulares neurônios, em seguida, mude para o objetivo 40X e refoque a amostra.
Selecione e aplique AlexaFluor 488 na janela da lista Corantes. Para evitar a superexposição e o branqueamento fotográfico dos fluoroforos, comece com configurações de baixa HV e laser. Para o canal AlexaFluor 488, defina o HV para 500, o ganho para 1x e o deslocamento para zero.
Defina a potência para 5% para a linha laser 488. Aumente o tamanho do pinhole para 300 micrômetros e use a opção de varredura focus x2 para ajustar os sinais de emissão de forma ideal aos níveis de subsaturação. As configurações podem então ser ajustadas para a melhor visibilidade de cada canal.
Uma vez que as configurações do microscópio sejam otimizadas, mova o estágio para localizar uma região com múltiplas células exibindo alterações espontâneas na fluorescência GCaMP6f e foque no plano desejado para a imagem. Use a ferramenta Clip rect para prender o quadro de imagem a um tamanho que pode alcançar um intervalo de quadro de pouco menos de um segundo. Defina a janela de intervalo para um valor de 1.0 e a janela Num para 600.
Para capturar um filme da série T, selecione a opção Tempo e use a opção de digitalização Xyt para iniciar a imagem. Observe a barra de progresso de imagem e mova a linha do buffer de gravação hepes para o buffer de gravação de 20 micromolar no ponto de partida apropriado. Quando a imagem estiver concluída, selecione o botão feito da série e salve o filme final da série T.
Continue perfunde o glutamato por mais cinco minutos para que a cultura dos neurônios tenha sido exposta ao glutamato por um total de 10 minutos. Repita este processo para que cada deslizamento de cobertura seja imageado. É possível ver traços de cálcio e corpos de células neuronais imediatamente após o experimento.
Use a ferramenta Elipse para desenhar o número desejado de ROIs em torno da soma neuronal. E use o botão Análise de séries para visualizar os traços. Após a exposição adicional de cinco minutos ao glutamato, remova o deslizamento da tampa do banho com fórceps finos e coloque-o de volta na placa de Petri com o tampão de gravação até que todas as imagens sejam concluídas.
No dia da imagem, as culturas VM foram tratadas com glutamato ou uma combinação de glutamato e NBQX. Em ambas as condições, foram observadas alterações heterogêneas e espontâneas no GCaMP6f florescence indicando fluxos espontâneos de cálcio. A aplicação do glutamato gerou uma resposta robusta e sustentada de cálcio em neurônios espontaneamente ativos e quiescentes.
A aplicação do NBQX reduziu a atividade espontânea e bloqueou parcialmente a resposta ao glutamato. A medida em que a aplicação do glutamato estimulou uma resposta de cálcio em cada condição foi quantificada usando a área sob a curva, amplitude de pico e latência para responder. A latência à resposta aumentou sob a condição de NBQX e glutamato.
Para medir a apoptose mediada pelo glutamato, as células foram fixadas e manchadas com um anticorpo anti-Caspase-3. A intensidade média do caspase-3 foi significativamente maior em ambas as condições de tratamento em comparação com os controles não tratados. Uma análise mais minuciosa da morte celular tóxica excitada pode ser feita contando o número de neurônios dopaminérgicos de imunostain tyrosine positivos em controle e condição tratada com glutamato.
Esta técnica abriu caminho para a compreensão das contribuições relativas de diferentes receptores e canais de ferro envolvidos na apoptose mediada pelo cálcio no neurônio dopaminérgico.
