Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NEI-midler inden for intramural. Forfatterne oprigtigt anerkende Dr. Sheldon Miller for hans videnskabelige vejledning, teknisk rådgivning, og ekspertise i RPE fysiologi og sygdom. Forfatterne takker Megan Kopera og dyrepleje personale til styring af musen kolonier, og Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou, og Yuan Wang for teknisk support.

Denne protokol følger de retningslinjer for dyrepleje, der er skitseret i dyreforsøgsprotokollen, der er godkendt af Animal Care and Use Committee of the National Eye Institute.
1. Import af lysstimuleringsprotokoller til DC-ERG
BEMÆRK: Følg nedenstående anvisninger for at importere lysstimuleringsprotokollerne for DC-ERG til ERG-systemsoftwaren (Materialetabel). Protokollen består af en 0,5 min pre-stimulus interval, efterfulgt af et trin af ly...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).</li><li>Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy.">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+Leber's+congenital+amaurosis.">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Inherited+Retinal+Degeneration+with+Photoreceptor+Cell+Loss.">Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss.</a> Cells. 9 (4), (2020).</li><li>Shrock, E., G&#252;ell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+Animals+and+Animal+Models.">CRISPR in Animals and Animal Models.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).</li><li>Smalley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+mouse+model+boom,+rat+model+renaissance.">CRISPR mouse model boom, rat model renaissance.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).</li><li>Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Murine+Retinal+Function+by+Electroretinography.">Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography.</a> Bio Protocol. 7 (7), (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phagolysosomal+activity+by+miR-204+critically+influences+structure+and+function+of+retinal+pigment+epithelium/retina.">Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).</li><li>Samuels, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Kritiske trin
En god DC-ERG optagelse kræver stabile elektroder, der er fri for bobler, der skaber artefakter og uønsket drift, da de er ekstremt følsomme over for udgasning og temperaturændringer. Det er vigtigt, at der opnås en stabil basislinje, når elektroderne placeres i HBSS-badopløsningen, før du går videre med museregistreringen. Små bobler har tendens til at samle sig i bunden af kapillær elektroden eller omkring silikonepakningen og er svære at se, når e...

Den retinale pigment epitel (RPE) er en monolayer af specialiserede celler, linje den bageste segment af øjet og udøve kritiske funktioner til at opretholde retinale homøostase1. RPE understøtter fotoreceptorer ved at regenerere deres foton-fanger visuelle pigment i en proces kaldet denvisuelle cyklus 2, ved at deltage i den døgnfarlige fagocytose af kaste ydre segment tips3, og i transport af næringsstoffer og metaboliske produkter mellem fotoreceptorer og choriocapillaris4,5. Abnormiteter i RPE funktion ligger til grund for mange menneskelige retinale sygdomme, såsom aldersrelaterede makuladegeneration6, Leber's medfødte amaurosis7,8 ogBedste vitelliform makulad dystrofi9. Da donorøjevæv ofte er vanskelige at opnå udelukkende til forskningsformål, kan dyremodeller med genetiske modifikationer være en alternativ måde at undersøge udviklingen af retinalesygdomme 10,11. Derudover, fremkomsten og anvendelsen af CRISPR cas9 teknologi tillader nu genomiske introduktioner (knock-in) eller sletninger (knock-out) i en enkel, et-trins proces overgår begrænsninger af tidligere gen målretning teknologier12. Boomet i tilgængeligheden af nye musemodeller13 kræver en mere effektiv optagelsesprotokol til ikke-invasivt evaluere RPE-funktion.
Måling af RPE's lysbetalte elektriske reaktioner kan opnås ved hjælp af en direkte koblet elektroretinogram (DC-ERG) teknik. Når dc-ERG anvendes i kombination med konventionelle ERG-optagelser, der måler fotoreceptoren (a-wave) og bipolære (b-wave)celleresponser 14, kan den definere, hvordan responsegenskaberne for RPE ændrer sig med retinal degeneration15,16,17 ellerom RPE-dysfunktion går forud for fotoreceptortab. Denne protokol beskriver en metode tilpasset fra arbejdet i Marmorstein, Peachey, og kolleger, der først udviklede DC-ERG teknik16,18,19,20 og forbedrer reproducerbarhed og brugervenlighed.
DC-ERG-optagelsen er vanskelig at udføre på grund af den lange anskaffelsestid (9 min.), hvor enhver afbrydelse eller indførelse af støj kan komplicere fortolkningen af dataene. Fordelen ved denne nye metode er, at baselines nå stabil tilstand inden for en kortere tid at reducere sandsynligheden for, at dyret vil vække for tidligt fra anæstesi og er mindre tilbøjelige til boble dannelse i kapillær elektroder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

Den retinale pigment epitel (RPE) er en specialiseret monolag af celler strategisk placeret mellem nethinden og choriocapillaris at opretholde den generelle sundhed og strukturelle integritet fotoreceptorer. RPE er polariseret, udviser apisk og basalt placeret receptorer eller kanaler, og udfører vektoral transport af vand, ioner, metabolitter, og udskiller flere cytokiner.
In vivo noninvasive målinger af RPE-funktion kan foretages ved hjælp af direkte koblede ERGs (DC-ERGs). Metoden bag DC-ERG blev udviklet af Marmorstein, Peachey, og kolleger ved hjælp af et specialbygget stimuleringsoptagelsessystem og demonstrerede senere ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt system. DC-ERG-teknikken bruger glaskapillærer fyldt med Hanks buffersaltopløsning (HBSS) til at måle RPE's langsommere elektriske reaktioner fremkaldt af lysbetalte koncentrationsændringer i subretinale rum på grund af fotoreceptoraktivitet. Dc-ERG-optagelsens langvarige lysmulmulans og længde gør den sårbar over for drift og støj, hvilket resulterer i et lavt udbytte af brugbare optagelser. Her præsenterer vi en hurtig, pålidelig metode til at forbedre stabiliteten af optagelserne og samtidig reducere støj ved hjælp af vakuumtryk for at reducere / eliminere bobler, der skyldes udgasning af HBSS og elektrodeholderen. Derudover er strømledningsartefakter svækket ved hjælp af en spændingsregulator/strømbalator. Vi inkluderer de nødvendige lysstimuleringsprotokoller til et kommercielt tilgængeligt ERG-system samt scripts til analyse af DC-ERG-komponenterne: c-wave, hurtig svingning, let top og off response. På grund af den forbedrede lethed af optagelser og hurtig analyse workflow, denne forenklede protokol er særlig nyttig til måling af aldersrelaterede ændringer i RPE funktion, sygdomsprogression, og i vurderingen af farmakologisk intervention.

Figur 2 er et prøvedatasæt fra mus af miR-204 ko/ko cre/+ (betinget KO) og vilde typer (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ er mus med en betinget knockout af microRNA 204 i retinal pigment epitel. Disse mus genereres ved at krydse floxed miR-204 mus (produceret af NEIGEF)22 med VMD2-CRE mus23. MiR-204 er meget udtrykt i RPE, hvor det regulerer ekspressionen af proteiner afgørende for epitelfunktion, der opretholder stramme samling integritet (f.eks cl...

Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Her præsenterer vi en metode til registrering af lys-fremkaldte elektriske reaktioner af retinale pigment epitel (RPE) i mus ved hjælp af en teknik kendt som DC-ERGs første beskrevet af Marmorstein, Peachey, og kolleger i begyndelsen af 2000'erne.

Direkte koblet elektroretinogram (DC-ERG) til registrering af lys-fremkaldte elektriske svar af musen retinal pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

DC-ERG-teknikken kan anvendes til ikke-undvigende evaluering af retinale pigmentepitelfunktion til overvågning af aldersrelaterede ændringer eller sygdomsprogression og til vurdering af farmakologiske interventionsvirkninger. Denne teknik forbedrer DC-ERG reproducere evne og den nemme brug ved at forenkle kapillær elektrode forberedelse. Det kan også suppleres med en standard ohm software program til at lette analysen.Begynd med forsigtigt at skubbe en sprøjtenyle med 25 mål gennem silikonegummipakningen til elektrodeholderens bagvæg. Fyld bunden af elektrodeholderen med afgasset HBSS, mens nålen langsomt trækkes tilbage, idet man skal passe på ikke at indføre bobler, og udskifte gevindhætten uden at stramme. Sæt sprøjtenylen i igen for at fylde det tomme rum i hullet med HBSS og holde kapillæren vandret, mens du fylder for at forhindre, at opløsningen slipper ud af den anden ende.Tag fat i den fyldte kapillær i den bøjede ende, sæt langsomt den anden ende gennem den løsnede hætte, og stram skruehætten på plads. Vip elektrodeholderne med kapillærelektroderne opad, så eventuelle bobler kan flyde ud og afgas kapillærerne i et vakuumkammer i fem til 10 minutter. Slip derefter langsomt vakuum og genopfylde elektrodeholderne og glaskapillærerne, som vist.For at gøre en brugerdefineret stå for mikroelektrode indehaveren, fjerne de sorte polyacetal klip fra den ene side af en række otte T-klip og bruge en cylinder base med magnetiske kuglesamlinger bearbejdes i halve for at justere højden. Fastgør de modificerede T-clips til de magnetiske kuglemonteringsskruer med M3-størrelsesmøtrikker og et dias i ca. en tomme koniske træhåndtag, modificeret fra en bomuldsspidsrensepind, ind i stativet i en vinkel for at sikre mikroelektrodeholderen i den specialfremstillede T-clip magnetiske kuglespande. Brug derefter den sjældne jordarters magneter cylinder base til sikkert at placere den tilpassede elektrode holder stå på metalpladen på scenen, så en 360-graders rotation på en 180-graders akse.For at udføre en elektrodetest skal du først forsigtigt sænke de fuldt monterede HBSS-fyldte kapillære mikroelektroder i en lille beholder med HBSS. Sæt nåleknedlektroden og sølvchlorid-centreret pelletretrode i samme HBSS for at fuldføre kredsløbet og vælge eller oprette en passende identifikator til at beskrive den mus, der skal testes. Hvis du vil vælge den direkte koblede elektroretinogramprotokol, der skal udføres, skal du klikke på protokoller og vælge DC-ERG.Klik på kør. Der vises en dialogboks med patientoplysningerne. Hvis oplysningerne er korrekte, skal du klikke ja og fortsætte til trin et af seks.Luk dørene til Faraday buret og klik impedans at vise impedans mode. Kontroller, at værdierne for mundreference, halejord og optagelseselektroder er acceptable, og klik trin for at gå videre til trin fire ud af seks for at teste basisstabiliteten. Klik på Eksempel for at begynde at få vist sporingerne.Sporene skal være lave støjsvul med en top-til-top amplitude på mindre end 200 miks. For at placere musen og elektroderne til et eksperiment, bedøve hornhinden af en bedøvet mus med en dråbe på 5% proparacain saltsyre før dilatating hornhinden med en dråbe på 2,5% phenylephne HCL og 5% tropicamid. I ERG-systemsoftwaren skal du kontrollere, at den korrekte patient er valgt.Klik på protokoller. Vælg DC-ERG under protokolbeskrivelse, og klik på Kør. Klik på ja for at kontrollere, at den korrekte test udføres.Brug trin et af seks til at tænde et svagt rødt lys inde i kuplen og placere musen på et opvarmet optagebord. Brug spån til omhyggeligt telt huden af bagbenet. Og ved hjælp af den ene hånd til fast at holde nålen elektrode, skal du bruge den anden hånd til at indsætte elektroden subkutanely i det bageste ben for at sikre elektroden på plads.Placer reference sølv, sølvchlorid elektrode i dyrets mund, således at den centreret pellet hviler langs bag kinden og holdes på plads bag tænderne. Før kapillærelektroderne placeres på øjet, skal elektrodeholderen placeres med glaskapillærerne orienteret lodret og svirp elektrodeholderen med en pegefinger for at fjerne eventuelle bobler, der måtte være blevet indført. Brug en 25-gauge nål til at fylde kapillær spidser med HBSS og inspicere kapillærerne for at sikre, at der ikke er nogen luftbobler fanget i spidserne.Placer elektrodeholderstanden, så de åbne spidser på de HBSS-fyldte kapillærer er i let kontakt med hornhinden. Og pas på at undgå at indføre bobler, vende smøremiddel eye gel dispenser til at kassere de første dråber. Derefter placere en dråbe smøremiddel øjengel på hvert øje for at opretholde ledningsevne og for at forhindre udledning under optagelsen.Hvis du vil optage DC-ERGs, skal du klikke på trin for at vælge trin fem ud af seks og klikke på impedans for at bruge impedanskontrolskærmen til at undersøge modstanden i venstre og højre øjne. Impedansværdierne for optagelseselektroderne ved hvert øje skal være ens. Og impedansværdierne for både jord- og referenceelektroder skal være mindre end 10 kilohms.Klik på eksempel for at få vist sporene for venstre og højre øjne, og vent op til 10 minutter på, at der opnås en stabil grundlinje. Klik derefter på Stop for at afslutte sporingseksemplet, og klik på Kør for at starte optagelsen. Her vises et eksempeldatasæt fra betinget knockout og vilde mus.I denne analyse led sporingen af små bobler i elektroden. Det øgede top-til-top støj i sporet. I en separat analyse blev boblerne elimineret ved hjælp af vakuumkammeret, før mikroelektroderne blev samlet i elektrodeholderens stande.De bedst egnede linjer til de første 25 sekunder kan beregnes, så de drift-korrigerede svar kan replotted og amplituder af DC-ERG komponenter, der skal identificeres. Som forventet, reduceret udtryk for helbredelse 7,1 kalium kanaler i RPE i høj grad dæmper c-bølge og hurtig svingning, hvilket indikerer en betydelig svækkelse af retinale pigment epitel elektriske egenskaber. Her vises de relative amplituder af DC-ERG-komponenterne, normaliseret til vildtype og afbildet mod de relative to største lys-fremkaldte a-wave amplituder.Denne form for analyse kan afgøre, om rpe'ens reducerede elektriske reaktioner kan afstÃ ̧res ved at reducere fotoreceptoraktiviteten alene. Eller hvis der er en underliggende defekt, der stammer fra RPE. Husk at opnå en stabil baseline før du går videre til musen optagelse og at genansætte elektroderne med jævne mellemrum for bobler, der kan have været indført.Mørktilpassede ERG'er kan registreres før DC-ERG for at måle den kegledrevne retinale funktion. Lystilpassede ERG'er kan også udføres efter DC-ERG for at evaluere de kegledrevne retinale reaktioner.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW betjent Novel nanoliter Osmometer for Ice bindingsprotein Undersøgelser

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Produktion af disulfid-stabiliserede transmembrane peptidkomplekser til strukturelle studier

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

En High-throughput-kompatible FRET-baseret platform til identifikation og karakterisering af botulinumneurotoksin lyskæde modulatorer

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse af Bestilte Biomolekylær Strukturer af Self-samling af korte peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimering af syntetiske Proteiner: Identifikation af Interpositional Afhængigheder Angivelse Strukturelt og / eller funktionelt knyttet Rester

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese af Protein biokonjugater<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Kemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntese af ormelignende Miceller af synligt lys Mediated Dispersion polymerisering Brug Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Brug kapillarelektroforese at kvantificere organiske syrer fra Plant Tissue: En Test Case Undersøgelse<em&gt; Ægte kaffe</em&gt; Frø

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Indsigt i samspillet mellem aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Brug Single-Molecule force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...