Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door nei intramurale fondsen. De auteurs erkennen oprecht Dr. Sheldon Miller voor zijn wetenschappelijke begeleiding, technisch advies, en deskundigheid in fysiologie RPE en ziekte. De auteurs bedanken Megan Kopera en de dierenverzorging personeel voor het beheer van de muis kolonies, en Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, en Yuan Wang voor technische ondersteuning.

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging die zijn beschreven in het dierproevenprotocol dat is goedgekeurd door het Comité Dierverzorging en Gebruik van het Nationaal Ooginstituut.
1. Het invoeren van lichtstimulatieprotocollen voor DC-ERG
OPMERKING: Volg de onderstaande aanwijzingen om de lichtstimulatieprotocollen voor de DC-ERG te importeren in de ERG-systeemsoftware(Tabel van materialen). Het protocol bestaat uit een interval van 0,5...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).</li><li>Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy.">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+Leber's+congenital+amaurosis.">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Inherited+Retinal+Degeneration+with+Photoreceptor+Cell+Loss.">Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss.</a> Cells. 9 (4), (2020).</li><li>Shrock, E., G&#252;ell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+Animals+and+Animal+Models.">CRISPR in Animals and Animal Models.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).</li><li>Smalley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+mouse+model+boom,+rat+model+renaissance.">CRISPR mouse model boom, rat model renaissance.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).</li><li>Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Murine+Retinal+Function+by+Electroretinography.">Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography.</a> Bio Protocol. 7 (7), (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phagolysosomal+activity+by+miR-204+critically+influences+structure+and+function+of+retinal+pigment+epithelium/retina.">Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).</li><li>Samuels, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Kritieke stappen
Een goede DC-ERG opname vereist stabiele elektroden die vrij zijn van bellen die artefacten en ongewenste drift te creëren als ze zijn zeer gevoelig voor outgassing en temperatuurveranderingen. Het is essentieel dat een stabiele basislijn wordt bereikt wanneer de elektroden in de HBSS-badoplossing worden geplaatst voordat u verder gaat met de muisopname. Kleine belletjes hebben de neiging om te verzamelen aan de basis van de capillaire elektrode of rond de si...

Het retinale pigment epitheel (RPE) is een monolaag van gespecialiseerde cellen die het achterste segment van het oog lijn en kritische functies uit te oefenen om retinale homeostase1te behouden. De RPE ondersteunt fotoreceptoren door hun foton-vastleggen visuele pigment in een proces genaamd de visuele cyclus2, door deel te nemen aan de dagelfcytose van schuur buitenste segment tips3, en in het vervoer van voedingsstoffen en metabole producten tussen fotoreceptoren en de chocaprioillaris4,5. Afwijkingen in RPE functie liggen ten grondslag aan tal van menselijke retinale ziekten, zoals leeftijdsgebonden macula degeneratie6, Leber's aangeboren amaurosis7,8 en Beste vitelliform macula dystrofie9. Aangezien donoroogweefsels vaak moeilijk te verkrijgen zijn uitsluitend voor onderzoeksdoeleinden, kunnen diermodellen met genetische modificaties een alternatieve manier bieden om de ontwikkeling van netvliesziekten te bestuderen10,11. Bovendien, de opkomst en toepassing van CRISPR cas9-technologie maakt nu genomische introducties (knock-in) of schrappingen (knock-out) mogelijk in een eenvoudig proces in één stap dat de beperkingen van eerdere gentargetingtechnologieën overtreft12. De hausse in de beschikbaarheid van nieuwe muismodellen13 vereist een efficiënter opnameprotocol om de RPE-functie niet-invasief te evalueren.
Meting van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de RPE kan worden bereikt met behulp van een direct-gekoppelde elektroretinogram (DC-ERG) techniek. Bij gebruik in combinatie met conventionele ERG-opnames die de fotoreceptor (a-wave) en bipolaire (b-wave) celreacties14meten, kan de DC-ERG definiëren hoe de responseigenschappen van de RPE veranderen met retinale degeneratie15,16,17 of dat RPE-disfunctie voorafgaat aan fotoreceptorverlies. Dit protocol beschrijft een methode aangepast aan het werk van Marmorstein, Peachey, en collega's die voor het eerst ontwikkelde de DC-ERG techniek16,18,19,20 en verbetert de reproduceerbaarheid en het gebruiksgemak.
De DC-ERG opname is moeilijk uit te voeren vanwege de lange aanschaftijd (9 min) waarin elke onderbreking of introductie van ruis de interpretatie van de gegevens kan bemoeilijken. Het voordeel van deze nieuwe methode is dat de basislijnen binnen een kortere tijd stabiel bereik bereiken, waardoor de kans dat het dier voortijdig ontwaakt uit anesthesie vermindert en minder gevoelig is voor bellenvorming in de capillaire elektroden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

Het retinale pigment epitheel (RPE) is een gespecialiseerde monolaag van cellen strategisch gelegen tussen het netvlies en de choriocapillaris die de algehele gezondheid en structurele integriteit van de fotoreceptoren te behouden. De RPE is gepolariseerd, vertoont apically en basaal gelegen receptoren of kanalen, en voert vectoraal transport van water, ionen, metabolieten, en scheidt verschillende cytokinen.
In vivo kunnen niet-invasieve metingen van de RPE-functie worden uitgevoerd met behulp van direct-coupled ERG's (DC-ERG's). De methodologie achter de DC-ERG werd gepionierd door Marmorstein, Peachey, en collega's met behulp van een op maat gebouwd stimulatie opnamesysteem en later aangetoond met behulp van een commercieel beschikbaar systeem. De DC-ERG techniek maakt gebruik van glazen haarvaten gevuld met Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) om de tragere elektrische reacties van de RPE te meten die ontlokt worden van lichtopgevraagde concentratieveranderingen in de subretinale ruimte als gevolg van fotoreceptoractiviteit. De langdurige lichte stimulus en lengte van de DC-ERG opname maken het kwetsbaar voor drift en ruis wat resulteert in een lage opbrengst van bruikbare opnames. Hier presenteren we een snelle, betrouwbare methode voor het verbeteren van de stabiliteit van de opnames, terwijl het verminderen van ruis met behulp van vacuümdruk te verminderen / te elimineren bellen die voortvloeien uit outgassing van de HBSS en elektrode houder. Bovendien, power line artefacten worden verzwakt met behulp van een spanningsregelaar / power conditioner. We bevatten de nodige lichtstimulatieprotocollen voor een commercieel beschikbaar ERG-systeem en scripts voor analyse van de DC-ERG-componenten: c-wave, snelle oscillatie, lichtpiek en off response. Vanwege het verbeterde gemak van opnames en snelle analyse workflow, dit vereenvoudigde protocol is vooral nuttig bij het meten van leeftijdsgebonden veranderingen in RPE functie, ziekte progressie, en bij de beoordeling van farmacologische interventie.

Figuur 2 is een voorbeeldgegevensset van miR-204 ko/ko cre/+ (voorwaardelijke KO) en wild type (WT) muizen. MiR-204 ko/ko cre/+ zijn muizen met een voorwaardelijke knock-out van microRNA 204 in het retinale pigment epitheel. Deze muizen worden gegenereerd door het kruisen van floxed miR-204 muizen (geproduceerd door NEIGEF)22 met VMD2-CRE muizen23. MiR-204 wordt sterk uitgedrukt in de RPE waar het regelt de expressie van eiwitten die cruciaal z...

Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Hier presenteren we een methode voor het opnemen van licht-opgeroepen elektrische reacties van het retinale pigment epitheel (RPE) in muizen met behulp van een techniek bekend als DC-ERGs voor het eerst beschreven door Marmorstein, Peachey, en collega's in de vroege jaren 2000.

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) voor het opnemen van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de Muis Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

De DC-ERG-techniek kan worden gebruikt voor de niet-ontwijkende evaluatie van de epitheelfunctie van het netvliespigment om leeftijdsgerelateerde veranderingen of ziekteprogressie te monitoren en farmacologische interventieeffecten te beoordelen. Deze techniek verbetert bij DC-ERG reproduceren vermogen en het gebruiksgemak door het vereenvoudigen van de capillaire elektrode voorbereiding. Het kan ook worden aangevuld met een standaard ohm software applicatie om analyse te vergemakkelijken.Begin met het voorzichtig schuiven van een 25-gauge spuitnaald door de siliconen rubberen pakking naar de achterwand van de elektrodehouder. Vul de basis van de elektrodehouder met ontgast HBSS terwijl u de naald langzaam intrekt, zorg ervoor dat er geen bellen worden geïntroduceerd en vervang de schroefdraaddop zonder aandraaien. Plaats de spuitnaald opnieuw om de lege ruimte in de opening met HBSS op te vullen en de capillaire horizontaal vast te houden tijdens het vullen om te voorkomen dat de oplossing aan de andere kant ontsnapt.Pak het gevulde capillair aan het gebogen uiteinde vast, steek het andere uiteinde langzaam door de losgemaakte dop en draai de schroefdop op zijn plaats. Kantel de elektrodehouders met de capillaire elektroden naar boven gericht om eventuele bellen naar buiten te laten stromen en de haarvaten gedurende vijf tot tien minuten in een vacuümkamer te ontgassen. Laat vervolgens langzaam het vacuüm los en vul de elektrodehouders en glasvattillaries bij, zoals aangetoond.Om een aangepaste standaard te maken voor de micro-elektrodenhouder, verwijdert u de zwarte polyacetale clips van één kant van een nummer acht T-clip en gebruikt u een cilinderbasis met magnetische kogelgewrichten die in de helft worden bewerkt om de hoogte aan te passen. Zet de gemodificeerde T-clips vast aan de magnetische kogelmontageschroeven met M3-formaat moeren en een schuif in ongeveer een-inch taps toelopende houten handvat, gewijzigd van een katoenen tip reinigingsstok, in de standaard onder een hoek om de micro-elektrodrode houder veilig in de op maat gemaakte T-clip magnetische bal gewrichtsstandaard. Gebruik vervolgens de cilinderbasis van zeldzame aardmagneten om de aangepaste elektrodehouder op de metalen plaat van het podium te plaatsen, waardoor een rotatie van 360 graden op een 180-gradenas mogelijk is.Om een elektrodetest uit te voeren, moet u eerst voorzichtig de volledig geassembleerde HBSS-gevulde capillaire micro-elektroden in een kleine container van HBSS laten zakken. Plaats de naaldgrondelektrode en de zilver-, zilverchloride-gecentreerde pelletreferentieelektrode in dezelfde HBSS om het circuit te voltooien en selecteer of maak een geschikte id om de te testen muis te beschrijven. Als u het direct gekoppelde elektroretinogramprotocol wilt selecteren dat moet worden uitgevoerd, klikt u op protocollen en selecteert u DC-ERG.Klik op uitvoeren. Er verschijnt een dialoogvenster met de patiëntgegevens. Als de informatie juist is, klikt u op ja en gaat u verder met stap één van de zes.Sluit de deuren van de kooi van Faraday en klik op impedantie om de impedantiemodus weer te geven. Controleer of de waarden voor de mondverwijzing, de staartgrond en de registratie van elektroden aanvaardbaar zijn en klik op stap vier van zes om de basisstabiliteit te testen. Klik op voorbeeld om de sporen te bekijken.De sporen moeten weinig ruis hebben met een piek-tot-piek amplitude van minder dan 200 microvolt. Om de muis en elektroden te positioneren voor een experiment, verdoven het hoornvlies van een verdoofde muis met een druppel van 5% proparacaine zoutzuur voordat het hoornvlies verwijdt met een druppel van 2,5% fenylephrine HCL en 5% tropicamide. Controleer in de ERG-systeemsoftware of de juiste patiënt is geselecteerd.Klik op protocollen. Selecteer onder protocolbeschrijving DC-ERG en klik op uitvoeren. Klik op ja om te controleren of de juiste test wordt uitgevoerd.Gebruik stap één van de zes om een zwak rood lampje in de koepel in te schakelen en de muis op een verwarmde opnametafel te plaatsen. Gebruik tangen om de huid van het achterbeen voorzichtig te vertenten. En met behulp van een hand om stevig vast te houden van de naald elektrode, gebruik de andere hand om de elektrode onderhuids in het achterste been om de elektrode op zijn plaats te zetten.Plaats de referentie zilver, zilverchloride elektrode in de mond van het dier, zodat de gecentreerde pellet rust langs de rug wang en wordt op zijn plaats gehouden achter de tanden. Voordat u de haardelektrode op het oog plaatst, plaatst u de elektrodehouder met de glazen haarvaten verticaal georiënteerd en veegt u de elektrodehouder met een wijsvinger om eventuele bellen te verwijderen die mogelijk zijn geïntroduceerd. Gebruik een naald van 25 meter om de haarvaten te vullen met HBSS en inspecteer de haarvaten om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de uiteinden zitten.Plaats de elektrodehouderstandaard zodat de open uiteinden van de met HBSS gevulde haarvaten in zacht contact staan met het hoornvlies. En zorg ervoor dat u geen bellen inbrengt, omkert de glijmiddel ooggeldispenser om de eerste druppels weg te gooien. Plaats vervolgens een druppel glijmiddel ooggel op elk oog om de geleidbaarheid te behouden en uitdroging tijdens de opname te voorkomen.Als u de DC-ERGs wilt opnemen, klikt u op stap vijf van zes en klikt u op impedantie om het scherm voor impedantiecontrole te gebruiken om de weerstanden van de linker- en rechterogen te onderzoeken. De impedantiewaarden voor de opnameelektroden aan elk oog moeten vergelijkbaar zijn. En de impedantiewaarden voor zowel de grond- als referentieelektroden moeten minder dan 10 kilohms zijn.Klik op voorbeeld om de sporen voor de linker- en rechterogen te bekijken en wacht tot 10 minuten tot een stabiele basislijn wordt bereikt. Klik vervolgens op stoppen om het tracepvoorbeeld af te sluiten en klik op uitvoeren om de opname te starten. Hier wordt een voorbeeldgegevensset van voorwaardelijke knock-out en wild-type muizen weergegeven.In deze analyse, het spoor last van minuten bellen in de elektrode. Het verhoogde het piek-tot-piekgeluid in het spoor. In een aparte analyse werden de bellen geëlimineerd met behulp van de vacuümkamer voordat de micro-elektroden in de elektrodehouderstands werden gemonteerd.De best passende lijnen van de eerste 25 seconden kunnen worden berekend, waardoor de drift-gecorrigeerde reacties kunnen worden gerepliceerd en de amplitudes van de DC-ERG componenten kunnen worden geïdentificeerd. Zoals verwacht, verminderde expressie van genezing 7.1 kaliumkanalen in de RPE sterk verzwakt de c-golf en snelle oscillatie, wat wijst op een aanzienlijke aantasting van het netvlies pigment epitheel elektrische eigenschappen. Hier worden de relatieve amplitudes van de DC-ERG componenten getoond, genormaliseerd tot wildtype en uitgezet tegen de twee grootste licht-opgeroepen a-wave amplitudes.Deze vorm van analyse kan bepalen of de verminderde elektrische reacties van de RPE kunnen worden verantwoord door de vermindering van fotoreceptoractiviteit alleen. Of als er een onderliggend defect is dat afkomstig is van de RPE. Vergeet niet om een stabiele basislijn te bereiken voordat u naar de muisopname gaat en de elektroden periodiek opnieuw te bezichtigen op bellen die mogelijk zijn geïntroduceerd.Donkere en aangepaste ERG's kunnen voorafgaand aan de DC-ERG worden geregistreerd om de kegelgestuurde retinale functie te meten. Licht aangepaste ERGs kunnen ook worden uitgevoerd na de DC-ERG om de kegel-gedreven retinale reacties te evalueren.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW bediende Novel nanoliter Osmometer voor Ice Bindend Eiwit Onderzoeken

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Vorming van Bestelde Biomoleculaire structuren door de zelf-assemblage van korte peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimalisatie van synthetische eiwitten: Identificatie van interpositioneel afhankelijkheden Indicating structureel en / of functioneel verbonden Residuen

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthese van Worm-micellen door het zichtbare licht Mediated Dispersion polymerisatie onder toepassing van Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Met behulp van capillaire elektroforese te kwantificeren organische zuren uit Plant Tissue: A Case Test Onderzoeken<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Zaden

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...