Name: unraveling the role of discrete areas of the rat brain in the regulation of ovulation through reversible inactivation by tetrodotoxin microinjections
Uploaded: 2020-09-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections at JoVE.

Vi er taknemmelige for Raymond Sanchez på University of Washington for hans værdifulde hjælp i manuskriptredigering og for at M.Sc Georgina Cortés og M.Sc. Cintia Javier for deres tekniske støtte i standardiseringen af denne teknik. Vi er også taknemmelige for medlemmerne af dyrlægen tjenester på Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández og MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán for fremragende vedligeholdelse og pleje af forsøgsdyr. De eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol, blev støttet af DGAPA-PAPIIT-bevillingsnummer: IN216015 og af CONACyT-tilskudsnummer: 236908 til Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva er ph.d.-studerende fra Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og støttes af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Grant nummer: 294555).

Procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af Den Etiske Komité for Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Denne institution opererer i nøje overensstemmelse med de mexicanske regler for håndtering af dyr, Official Norm: NOM-062-ZOO-1999, som er i overensstemmelse med internationale retningslinjer.
1. Opførelse af bilaterale kanyler
<ol><li>Uddrag rustfrit stål akslen fra navet af to 23 G hypodermiske nåle ved hjælp af tryk pincet og derefter fjerne eventuelle resterende l...

Denne artikel beskriver en metode til at forbigående inaktivere, på et givet tidspunkt, en diskret region i hjernen af vågen og uhæmmet rotter. Der findes også en enkel metode til at spore deres estrøse cyklus og vurdere ægløsning. Denne protokol giver mulighed for en simpel analyse af specifikke hjerneområders bidrag til de mekanismer, der driver ægløsning ved at sammenligne ægløsningsresultatet af TTX-behandlede dyr med det køretøjsbehandlede dyr. Med undtagelse af det stereotaxiske instrument og mikroin...

Ægløsning er den proces, hvorved en eller flere modne oocytter frigives fra æggestokkene, når hver estral / menstruationscyklus. Da alle pattedyrarter er afhængige af produktionen af gameter til at opdrætte, har forståelsen af de mekanismer, der regulerer ægløsning, en enorm indvirkning i områder lige fra biomedicin, husdyrindustrien og vedligeholdelse af truede arter. Ægløsning er reguleret af hypothalamus-hypofyse-æggestokkene akse, som involverer flere hypothalamus og ekstra-hypothalamus områder, gonadotropes i den forreste hypofyse og theca og granulosa celler, der sammen med oocytter, danner æggestokkene follikler inde i æggestokkene1.
Ovarie follikler vokse, udvikle og i sidste ende ægløsning som reaktion på tonic og phasic sekretion af follikel-stimulerende hormon og luteiniserende hormon, de to gonadotropins udskilles af gonadotropes. Mønsteret af gonadotropin sekretion er afgørende for korrekt follikulær udvikling og ægløsning, og det er reguleret af gonadotropin-frigive hormon (GnRH)1,2. Denne neuropeptid syntetiseres af neuroner spredt over hele basal diencephalon og udskilles derefter til portalen vaskulatur, der forbinder hypothalamus og den forreste hypofyse. GnRH-neuronernes sekretoriske aktivitet moduleres igen af synaptisk input, der opstår fra forskellige hjernestrukturer. Disse strukturer formidler oplysninger om tilstanden af organismens ydre og indre miljø, herunder tilgængeligheden af mad, længden af fotoperioden og koncentrationen af hormoner i blodet. I denne forstand former de hver arts reproduktive mønster, og de specifikke roller af sådanne strukturer skal bestemmes for korrekt at forstå de mekanismer, der styrer ægløsning. Som et eksempel har det vist sig, at udsvingene i estradiol niveauer i løbet af estrous cyklus regulerer udskillelsen af GnRH; GnRH-neuroner udtrykker dog ikke den estradiol receptorisoform, der er nødvendig for at opdage sådanne ændringer. To populationer af neuroner, der udtrykker disse receptorer, er placeret i rostralperiventrikulære region i den tredje ventrikel og i arcuatekernen og stablish synapser med GnRH-neuroner. Der er tegn på, at disse neuroner fortolker koncentrationen af estradiol og derefter stimulere aktiviteten af GnRH-neuroner ved at frigive kisspeptin, en potent induktor af GnRH sekretion3.
Eksperimenter med termiske eller kemiske læsioner samt mekanisk deafferentation tillod forskere at bestemme inddragelsen af flere hjernestrukturer i reguleringen af ægløsning4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Disse eksperimenter har imidlertid den ulempe at være invasive og traumatiske, der kræver flere dages genopretning, før de evaluerer virkningerne af behandlingen, hvilket hæmmer analysen af de akutte virkninger af behandlingen. Derudover påvirker de permanent de målrettede områder og forstyrrer andre fysiologiske processer på lang sigt. På grund af disse problemer er resultaterne af disse eksperimenter normalt tilsløret af de homøostatiske kompenserende mekanismer i dyrets krop, og det er ret vanskeligt at udtrække nøjagtige oplysninger om den tidsmæssige lovgivningsmæssige dynamik, som området er involveret i.
Mikroinjektionen af lægemidler, der forbigående forstyrrer neuronernes aktivitet gennem guide kanyler, er et passende alternativ, der overgår de ulemper, der er nævnt ovenfor. Kanylerne kan placeres i enhver hjerneregion ved en stereotaxisk kirurgi, så forskeren kan starte lægemiddelbehandlingen efter de forvirrende virkninger af operationen forsvinder. Den tidsmæssige mikroinjektion af lægemidlerne gør det muligt for forskere at teste hypoteser om regionens bidrag til et bestemt trin i processen og kan udføres hos vågen beherskede eller frit bevægende dyr. En række lægemidler, herunder lokalbedøvelse, agonister, antagonister, inverse agonister og biologiske toksiner såsom tetrodotoxin (TTX) kan mikroin injiceres i regionen af interesse på bestemte tidspunkter.
TTX er et biologisk toksin syntetiseret af bakterier, der lever i lunderfiskens krop samt andre hvirveldyr og hvirvelløse dyr. TTX gør neural aktivitet lydløs gennem selektiv og forbigående blokade af natriumkanaler, hvilket resulterer i hæmning af natriumafhængige handlingspotentialer. I nærværelse af TTX oplever cellerne en ændring i depolariseringsfasen og er derfor ikke spændende, men forbliver i live. Den blokerende virkning af TTX forklares ved dens molekylære sammensætning: en guanidiniumgruppe er i stand til at passere gennem natriumkanalens ekstracellulære aspekt, men resten af molekylet kan ikke passere på grund af dets størrelse, så det sidder fast og blokerer kanalen13,14,15,16,17 . TTX's virkningsmekanisme gjorde det muligt at bruge den som et værktøj til at studere nervesystemet både in vitro og in vivo. Intracerebral injektion af dette toksin er blevet brugt til at studere den rolle diskrete hjerneområder i flere processer som hukommelse opbevaring18,søvn og ophidselse19, sted anerkendelse20,rumlig navigation21,stofmisbrug22, termoregulering23, udvikling af skizofreni24,seksuel adfærd25 og regulering af ægløsning26 blandt andet. I denne protokol beskriver vi virkningerne på ægløsning af den forbigående inaktivering af hypothalamus kerner ved TTX mikroinjektion hos vågen og uhæmmet rotter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#956;L Hamilton syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G x 1&#34; stainless steel hypdermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1&#34; stainless steel hypdermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; stainless steel hypdermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial cerebrospinal fluid</td>
			<td>BASi</td>
			<td>MD-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone trimer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16152-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burr for micro drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut-off disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>SM5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting tweezers</td>
			<td>Truper</td>
			<td>17367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanocrylate glue</td>
			<td>Kola loka</td>
			<td>K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>Nic Tone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxasin</td>
			<td>Senosiain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Bonn scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face mask</td>
			<td>Lanceta HG</td>
			<td>60036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxilin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypromelose artificial tears</td>
			<td>Sophia Labs</td>
			<td>8950015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pisa Agropecuaria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Aranda</td>
			<td>1183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monomer</td>
			<td>Nic Tone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mototool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Lanceta HG</td>
			<td>69028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Dermo Dine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine with soap</td>
			<td>Germisin espuma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure tweezers</td>
			<td>Truper</td>
			<td>17371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anesthesia mask</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10015-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Pisa Agropecuaria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard electrode holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>1770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel wire</td>
			<td>American Orthodontic</td>
			<td>856-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Sissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon connectors</td>
			<td>Basi</td>
			<td>MD-1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tubing</td>
			<td>Basi</td>
			<td>MF-5164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Alomone labs</td>
			<td>T-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>VetFlo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the role of discrete areas of the rat brain in the regulation of ovulation through reversible inactivation by tetrodotoxin microinjections

Mange eksperimentelle tilgange er blevet brugt til at studere hjernens rolle i reguleringen af ægløsning. Eksempler omfatter læsion og deafferentation af neuronale grupper, som begge er invasive metoder, der permanent forringe integriteten af målområdet. Disse metoder ledsages af følgevirkninger, der kan påvirke analysen af akutte og tidsmæssige reguleringsmekanismer. Den stereotaxiske implantation af guide kanyler rettet mod specifikke hjerneområder, efterfulgt af en restitutionsperiode, gør det muligt for forskere at mikroinject forskellige lægemidler efter forsvinden af uønskede virkninger af operationen. Tetrodotoxin er blevet brugt til at bestemme rollerne i flere hjerneområder i forskellige fysiologiske processer, fordi det forbigående hæmmer natriumafhængige handlingspotentialer og dermed blokerer al neural aktivitet i målregionen. Denne protokol kombinerer denne metode med strategier for vurdering af den estrøse cyklus og ægløsning for at afsløre den rolle, diskrete hjerneområder i reguleringen af ægløsning på bestemte tidspunkter af et givet stadium af den estrøse cyklus. Vågne og hæmningsløse rotter (Rattus norvegicus) blev brugt til at undgå de blokerende virkninger, som bedøvelses- og stresshormoner udøver på ægløsning. Denne protokol kan let tilpasses andre arter, hjernemål og farmakologiske midler for at studere forskellige fysiologiske processer. Fremtidige forbedringer af denne metode omfatter design af et mikroinjektionssystem ved hjælp af glaskapillærer med lille diameter i stedet for guide kanyler. Dette vil reducere mængden af væv beskadiget under implantationen og mindske spredningen af de infunderede lægemidler uden for målområdet.

Den ovenfor beskrevne protokol blev afprøvet ved at vurdere virkningerne af et enkelt TTX eller køretøj (kunstig cerebrospinalvæske; ACSF) mikroinjektion i en af to forskellige kerner, der vides at være involveret i reguleringen af ægløsning i rotten: suprachiasmatic og arcuatekernen. Den suprachiasmatiske kerne blev valgt, da den indeholder den centrale døgnrytmemager hos pattedyr. Det er involveret i reguleringen af cykliske begivenheder som udskillelse af gonadotropiner. Den arcuate kerne blev valgt, fordi den...

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections at JoVE.

Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections

Denne protokol beskriver opførelsen af et billigt mikroinjektionssystem, dets stereotaxiske implantation i dybhjernestrukturer og proceduren for tidsurige mikroinjektioner af tetrodotoksin hos vågne og hæmningsløse rotter. Målet er at afsløre deltagelsen af hypothalamus strukturer i reguleringen af ægløsning ved at hæmme deres neurale aktivitet.

Optrævling af de diskrete områder af rottehjernen i reguleringen af ægløsning gennem reversibel inaktivering af Tetrodotoxin Microinjections

Many experimental approaches have been used for studying the role of the brain in the regulation of ovulation. Examples include the lesion and ...

This protocol allows researchers to explore the nuclei of the neuronal circuits that regulates ovulation in female mammals at specific times of their estrous cycle.This technique can be adapted to study any process on the regulation of the brain in any species.Also they can less art fabricator in the lab lowering the overall cost.Demonstrating this procedure will be Montserrat Bola

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Emotion Regulation

The ability to control/regulate emotions is an important coping mechanism in the face of emotionally stressful situations. Although significant progress ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Optimeret Analyse af DNA methylering og genekspression fra små, anatomisk definerede områder af hjernen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaktisk kirurgi for excitotoksiske læsion af specifikke områder i hjernen i den voksne rotte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse af genekspression Ændringer i rottehippocampus Efter Deep Brain Stimulation af den forreste thalamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Udnytte Kombineret Metoder til Definer rolle plasmamembranen Delivery Under Axon Forgrening og neuronal Morfogenese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverførsel til Schwann-celler i Rodent iskiasnerven ved elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimation af DAN Matrix til påvisning og Visualisering af Gangliosider i Rat Brain Tissue for MALDI Imaging massespektrometri

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Personlig nåle til Microinjections i gnavere hjernen

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Translational Brain Mapping at the University of Rochester Medical Center: Preserving the Mind Through Personalized Brain Mapping

Translationel hjerne kortlægning ved University of Rochester Medical Center: bevarelse af sindet gennem personlig hjerne kortlægning

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, ...