Name: unraveling the role of discrete areas of the rat brain in the regulation of ovulation through reversible inactivation by tetrodotoxin microinjections
Uploaded: 2020-09-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections at JoVE.

Vi er takknemlige til Raymond Sanchez ved University of Washington for hans verdifulle hjelp i manuskriptredigering og for å M.Sc Georgina Cortés og M.Sc. Cintia Javier for deres tekniske støtte i standardiseringen av denne teknikken. Vi er også takknemlige for medlemmene av veterinærtjenestene ved Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández og MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán for utmerket vedlikehold og pleie av eksperimentelle dyr. Eksperimentene beskrevet i denne protokollen ble støttet av DGAPA-PAPIIT tilskuddsnummer: IN216015 og av CONACyT tilskuddsnummer: 236908 til Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva er doktorgradsstudent fra Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og støttes av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Tilskuddsnummer: 294555).

Prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av fakultetets etikkkomité de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Denne institusjonen opererer i henhold til de meksikanske reglene for dyrehåndtering, Offisiell norm: NOM-062-ZOO-1999, som er enig med internasjonale retningslinjer.
1. Bygging av bilaterale kanyler
<ol><li>Trekk ut skaftet i rustfritt stål fra navet på to 23 G hypodermiske nåler ved hjelp av trykk pinsett, og fjern deretter eventuelt gjenværende lim ved hjelp av et skalpellbla...

Denne artikkelen beskriver en metode for å midlertidig inaktivere, til enhver tid, en diskret region i hjernen til våken og uhemmet rotter. En enkel metode for å spore deres østrogen syklus og vurdere eggløsning er også gitt. Denne protokollen tillater en enkel analyse av bidraget fra spesifikke hjerneregioner til mekanismene som driver eggløsning ved å sammenligne det ovulatoriske utfallet av TTX-behandlede dyr med de kjøretøybehandlede. Med unntak av det stereotaktiske instrumentet og mikroinjeksjonspumpen, s...

Eggløsning er prosessen der en eller flere modne oocytter frigjøres fra eggstokkene en gang hver estral / menstruasjonssyklus. Siden alle pattedyrarter er avhengige av produksjon av gameter for å avle, har forståelsen av mekanismene som regulerer eggløsning en stor innvirkning på områder som spenner fra biomedisin, husdyrindustrien og vedlikehold av truede arter. Eggløsning er regulert av hypothalamus-hypofyse-ovarieaksen, som involverer flere hypothalamus og ekstra hypothalamus områder, gonadotropene i fremre hypofyse og theca og granulosa celler som sammen med oocytter danner eggstokkene follikler inne i eggstokkene1.
Ovariefoskler vokser, utvikler og til slutt eggløsning som svar på tonic og phasic sekresjon av follikkelstimulerende hormon og luteiniserende hormon, de to gonadotropins utskilt av gonadotropes. Mønsteret av gonadotropin sekresjon er avgjørende for riktig follikulær utvikling og eggløsning, og det er regulert av gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH)1,2. Dette nevropeptidet syntetiseres av nevroner spredt over hele basal diencephalon og utskilles deretter til portalvaskulaturen som forbinder hypothalamus og den fremre hypofysen. Sekretorisk aktivitet av GnRH-nevronene er igjen modulert av synaptiske innganger som oppstår fra forskjellige hjernestrukturer. Disse strukturene formidler informasjon om tilstanden til organismens ytre og indre miljø, inkludert tilgjengeligheten av mat, lengden på fotoperioden og konsentrasjonen av hormoner i blodet. I denne forstand former de reproduksjonsmønsteret til hver art, og de spesifikke rollene til slike strukturer må bestemmes for å forstå mekanismene som styrer eggløsningen riktig. Som et eksempel har det vist seg at svingningene i østradiolnivåer under østrogensyklusen regulerer sekresjonen av GnRH; GnRH-nevroner uttrykker imidlertid ikke østradiolreseptorens isoform som trengs for å oppdage slike endringer. To populasjoner av nevroner som uttrykker disse reseptorene ligger i rostral periventrikulær region i den tredje ventrikelen og i henholdsvis arcuate kjernen, og stablish synapser med GnRH-nevroner. Det er bevis som tyder på at disse nevronene tolker konsentrasjonen av østradiol og deretter stimulerer aktiviteten til GnRH-nevroner ved å frigjøre kisspeptin, en potent induktor av GnRH-sekresjon3.
Eksperimenter som involverertermiske eller kjemiske lesjoner, samt mekanisk døvhet, tillot forskere å bestemme involvering av flere hjernestrukturer i regulering av eggløsning4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Disse eksperimentene har imidlertid ulempen med å være invasiv og traumatisk, noe som krever flere dager med utvinning før de evaluerer effekten av behandlingen, noe som hindrer analysen av de akutte effektene av behandlingen. I tillegg påvirker de permanent de målrettede områdene og forstyrrer andre fysiologiske prosesser på lang sikt. På grunn av disse problemene er resultatene av disse eksperimentene vanligvis skjult av de homeostatiske kompenserende mekanismene i dyrets kropp og utvinning av nøyaktig informasjon om den tidsmessige regulatoriske dynamikken der området er involvert, er ganske vanskelig.
Mikroinjeksjonen av legemidler som midlertidig forstyrrer aktiviteten til nevroner gjennom guidekanyler, er et passende alternativ som overgår ulempene nevnt ovenfor. Kanylene kan plasseres i hvilken som helst hjerneregion ved en stereotaxisk kirurgi, slik at forskeren kan starte medikamentbehandlingen etter at de forvirrende effektene av operasjonen forsvinner. Den tidsbestemte mikroinjeksjonen av stoffene gjør det mulig for forskere å teste hypoteser om regionens bidrag til et bestemt trinn i prosessen og kan utføres i våken beherskede eller fritt bevegelige dyr. En rekke stoffer, inkludert lokalbedøvelse, agonister, antagonister, inverse agonister og biologiske giftstoffer som tetrodotoxin (TTX) kan mikroinjiseres i interesseområdet på bestemte tidspunkter.
TTX er et biologisk toksin syntetisert av bakterier som lever i pufferfishens kropp, så vel som andre vertebrater og hvirvelløse dyr. TTX stiller nevral aktivitet gjennom selektiv og forbigående blokade av natriumkanaler, noe som resulterer i hemming av natriumavhengige virkningspotensialer. I nærvær av TTX opplever celler en endring i depolariseringsfasen og er dermed ikke spennende, men forblir i live. Blokkeringseffekten av TTX forklares av sin molekylære sammensetning: En guanidiniumgruppe er i stand til å passere gjennom det ekstracellulære aspektet av natriumkanalen, men resten av molekylet kan ikke passere på grunn av størrelsen, så den sitter fast og blokkerer kanalen13,14,15,16,17 . Virkningsmekanismen til TTX tillot bruk som et verktøy for å studere nervesystemet både in vitro og in vivo. Intracerebral injeksjon av dette toksinet har blitt brukt til å studere rollen som diskrete hjerneområder i flere prosesser som minne oppbevaring18, søvn og opphisselse19, sted anerkjennelse20, romlignavigasjon 21, narkotikamisbruk22, termoregulering23, utvikling av schizofreni24, seksuell atferd25 og regulering av eggløsning26 blant andre. I denne protokollen beskriver vi effekten på eggløsning av forbigående inaktivering av hypothalamus nuklei av TTX mikroinjeksjon hos våken og uhemmet rotter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#956;L Hamilton syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G x 1&#34; stainless steel hypdermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1&#34; stainless steel hypdermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; stainless steel hypdermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial cerebrospinal fluid</td>
			<td>BASi</td>
			<td>MD-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone trimer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16152-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burr for micro drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut-off disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>SM5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting tweezers</td>
			<td>Truper</td>
			<td>17367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanocrylate glue</td>
			<td>Kola loka</td>
			<td>K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>Nic Tone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxasin</td>
			<td>Senosiain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Bonn scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face mask</td>
			<td>Lanceta HG</td>
			<td>60036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxilin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypromelose artificial tears</td>
			<td>Sophia Labs</td>
			<td>8950015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pisa Agropecuaria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Aranda</td>
			<td>1183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monomer</td>
			<td>Nic Tone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mototool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Lanceta HG</td>
			<td>69028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Dermo Dine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine with soap</td>
			<td>Germisin espuma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure tweezers</td>
			<td>Truper</td>
			<td>17371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anesthesia mask</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10015-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Pisa Agropecuaria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard electrode holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>1770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel wire</td>
			<td>American Orthodontic</td>
			<td>856-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Sissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon connectors</td>
			<td>Basi</td>
			<td>MD-1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tubing</td>
			<td>Basi</td>
			<td>MF-5164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Alomone labs</td>
			<td>T-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>VetFlo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the role of discrete areas of the rat brain in the regulation of ovulation through reversible inactivation by tetrodotoxin microinjections

Mange eksperimentelle tilnærminger har blitt brukt til å studere hjernens rolle i reguleringen av eggløsning. Eksempler er lesjon og døvhet av nevrongrupper, som begge er invasive metoder som permanent svekker integriteten til målområdet. Disse metodene ledsages av sikkerhetseffekter som kan påvirke analysen av akutte og tidsmessige reguleringsmekanismer. Stereotoksisk implantasjon av guidekanyler rettet mot bestemte hjerneregioner, etterfulgt av en gjenopprettingsperiode, gjør det mulig for forskere å mikroinjektere forskjellige stoffer etter at de uønskede effektene av operasjonen er forsvunnet. Tetrodotoxin har blitt brukt til å bestemme rollene til flere hjerneområder i ulike fysiologiske prosesser fordi det midlertidig hemmer de natriumavhengige virkningspotensialene, og dermed blokkerer all nevral aktivitet i målområdet. Denne protokollen kombinerer denne metoden med strategier for vurdering av østrogen syklus og eggløsning for å avsløre rollen som diskrete hjerneregioner i regulering av eggløsning på bestemte tidspunkter av et gitt stadium av østrogensyklusen. Våken og uhemmet rotter (Rattus norvegicus) ble brukt for å unngå de blokkerende effektene som bedøvelse og stresshormoner utøver på eggløsning. Denne protokollen kan enkelt tilpasses andre arter, hjernemål og farmakologiske midler for å studere ulike fysiologiske prosesser. Fremtidige forbedringer av denne metoden inkluderer utformingen av et mikroinjeksjonssystem ved hjelp av glass kapillærer med liten diameter i stedet for guidekanyler. Dette vil redusere mengden vev som er skadet under implantasjonen og redusere spredningen av de tilsatte stoffene utenfor målområdet.

Protokollen beskrevet ovenfor ble testet ved å evaluere effekten av en enkelt TTX eller kjøretøy (kunstig cerebrospinalvæske; ACSF) mikroinjeksjon i en av to forskjellige kjerner kjent for å være involvert i regulering av eggløsning i rotte: suprachiasmatic og arcuate kjernen. Den suprachiasmatiske kjernen ble valgt siden den inneholder den sentrale sirkadiske pacemakeren hos pattedyr. Det er involvert i regulering av sykliske hendelser som sekresjon av gonadotropiner. Den arcuate kjernen ble valgt fordi den inneh...

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections at JoVE.

Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections

Denne protokollen beskriver byggingen av et rimelig mikroinjeksjonssystem, dets stereotoksiske implantasjon i dyphjernestrukturer og prosedyren for tidsbestemte mikroinjeksjoner av tetrodotoxin hos våken og uhemmet rotter. Målet er å avsløre deltakelsen av hypothalamus strukturer i regulering av eggløsning ved å hemme deres nevrale aktivitet.

Unraveling rollen som diskrete områder av rottehjernen i regulering av eggløsning gjennom reversibel inaktivering av tetrodtoksin mikroinjeksjoner

Many experimental approaches have been used for studying the role of the brain in the regulation of ovulation. Examples include the lesion and ...

This protocol allows researchers to explore the nuclei of the neuronal circuits that regulates ovulation in female mammals at specific times of their estrous cycle.This technique can be adapted to study any process on the regulation of the brain in any species.Also they can less art fabricator in the lab lowering the overall cost.Demonstrating this procedure will be Montserrat Bola

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Emotion Regulation

The ability to control/regulate emotions is an important coping mechanism in the face of emotionally stressful situations. Although significant progress ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Optimalisert Analyse av DNA-metylering og Gene Expression fra små, anatomisk definerte områder i hjernen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaxic Kirurgi for Excitotoxic lesjon i spesifikke hjerneområder i Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse av genuttrykk Endringer i Rat Hippocampus Etter dyp hjernestimulering av fremre talamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utnytte Kombinert Metoder for å definere rollen til plasmamembranen Levering Under Axon Forgrening og neuronal morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverføring til Schwann celler i gnagere isjiasnerven ved Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimering av DAN Matrix for søking og visualisering av gangliosider i Rat hjernevev for MALDI Imaging massespektrometri

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Personlig pinner for Microinjections i gnager hjernen

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Translational Brain Mapping at the University of Rochester Medical Center: Preserving the Mind Through Personalized Brain Mapping

Translational Brain Mapping ved University of Rochester Medical Center: bevare Mind gjennom personlig Brain Mapping

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, ...