Name: a patient-derived xenograft model for venous malformation
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا بحيرات نورا على التدقيق اللغوي. وقد تم دعم البحوث التي تم الإبلاغ عنها في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم، تحت رقم الجائزة R01 HL117952 (E.B.)، وهي جزء من المعاهد الوطنية للصحة. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

تم الحصول على عينات أنسجة المريض من المشاركين بعد موافقة مستنيرة من جمع ومستودع عينات الأنسجة والبيانات من المرضى الذين يعانون من الأورام والشذوذ الوعائي بموجب مجلس مراجعة مؤسسية معتمد (IRB) لكل سياسات مؤسسية في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال (CCHMC) ومعهد السرطان وأمراض الدم وبمواف?...

<ol>
	<li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+malformation:+update+on+aetiopathogenesis,+diagnosis+and+management.">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations.">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li><li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations.">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation.">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li><li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans.">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).</li><li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices.">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li><li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+Models.">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889 (2019).</li><li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts.">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li><li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+collagen,+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks.">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).</li><li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen,+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices.">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations.">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li><li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations.">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li><li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+model+for+venous+malformation.">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation.">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li><li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation.">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects.">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li></ol>

هنا، نحن وصف طريقة لتوليد نموذج xenograft المستمدة من المريض من VM. يقدم هذا النموذج مورين نظام ممتاز يسمح للباحثين بالحصول على فهم أعمق لتوسيع التجويف المرضي وسيكون له دور فعال في تطوير علاجات أكثر فعالية واستهدافًا لعلاج VM. هذا يمكن تكييفها بسهولة للتحقيق في أنواع أخرى من الشذوذ الوعائي مثل ا...

العيوب في تطور الأوعية الدموية هي السبب الكامن وراء العديد من الأمراض بما في ذلك التشوهات الوريدية (VM). VM هو مرض خلقي يتميز بتشكل غير طبيعي وتوسع الأوردة1. وقد حددت الدراسات الهامة على أنسجة الجهاز الظاهري والخلايا البطانية (EC) اكتساب من الطفرات وظيفة في اثنين من الجينات: TEK، الذي يشفّر مستقبلات كيناز التيروزين TIE2، وPIK3CA، الذي يشفّر p110α (الوحدة الفرعية الحفازة) isoform PI3 كيناز (PI3K)2،3،4،5. هذه الطفرات الجسدية تؤدي إلى تنشيط فرط مستقل لليغانند من مسارات إشارة أوعية / النمو الرئيسية ، بما في ذلك PI3K / AKT ، مما أدى إلى الأوردة المتوسعة3. وعلى الرغم من هذه الاكتشافات الجينية الهامة، فإن الآليات الخلوية والجزيئية اللاحقة التي تؤدي إلى تكوين الأوعية الدموية غير الطبيعية وتشكيل قنوات الأوعية الدموية الموسعة لا تزال غير مفهومة تماماً.
خلال تولد الأوعية الدموية الطبيعية والمرضية، تنبت أوعية جديدة من شبكة الأوعية الدموية الموجودة من قبل و EC تخضع سلسلة من العمليات الخلوية الهامة بما في ذلك الانتشار والهجرة وإعادة عرض المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتشكيل التجويف6. ثنائي وثلاثي الأبعاد (2D/3D) في الثقافات في المختبر EC هي أدوات هامة للتحقيق في كل من هذه الخصائص الخلوية بشكل فردي. ومع ذلك، هناك طلب واضح لنموذج الماوس الذي يلخص تضخم الأوعية المرضية داخل البيئة الصغيرة المضيفة مع توفير منصة فعالة للتقييم قبل السريري للأدوية المستهدفة للبحوث الانتقالية.
وحتى الآن، لم يتم الإبلاغ عن نموذج مورين معدل وراثياً لـ VM مرتبط بطفرات اكتساب الوظيفة من 11 إلى 100. تعتمد نماذج الماوس VM الحالية المعدلة على التعبير في كل مكان أو مقيد بالأنسجة من الطفرة النشطة PIK3CA p.H1047R3،5. هذه الحيوانات المعدلة وراثيا توفر رؤية كبيرة في الجسم كله أو الأنسجة آثار محددة من هذه النقطة الساخنة PIK3CA الطفرة. الحد من هذه النماذج هو تشكيل شبكة الأوعية الدموية المرضية للغاية مما أدى إلى الفتك المبكر. وبالتالي ، فإن هذه النماذج الماوس لا تعكس تماما حدوث متقطع من الأحداث الطفرة والطبيعة المترجمة من أمراض VM.
على العكس من ذلك ، تعتمد نماذج xenograft المستمدة من المريض على زرع أو حقن الأنسجة المرضية أو الخلايا المشتقة من المرضى إلى الفئران المناعية7. نماذج Xenograft هي أداة قوية لتوسيع المعرفة حول تطور المرض واكتشاف وكلاء علاجية جديدة8. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الخلايا المشتقة من المريض يسمح للعلماء بتكبيل التغايرية الطفرة لدراسة طيف الأنماط الظاهرية للمريض.
هنا، ونحن وصف بروتوكول حيث يتم حقن المرضى المستمدة VM EC التي تعبر عن شكل متحولة نشطة من TIE2 و /أو PIK3CA تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران عارية athymic. يتم تعليق الخلايا الوعائية عن طريق الحقن في إطار ECM من أجل تعزيز تولد الأوعية الدموية كما هو موضح في النماذج السابقة xenograft الأوعية الدموية9,10,11. تخضع هذه VM EC لتحولات morphogenesi كبيرة وتولد أوعية مرضية موسعة ومُلّقة في غياب الخلايا الداعمة. يوفر نموذج xenograft الموصوف لـ VM منصة فعالة للتقييم قبل الكلينيكي للأدوية المستهدفة لقدرتها على منع التوسع غير المنضبط في تجويف التجويف.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1065</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &#181;M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>974106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>BSA</td>
			<td>A7906-50MG</td>
			<td>Cell culture; Histological analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50996491</td>
			<td>Lesion plug measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11155D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (100 &#956;M)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 241</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 239</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>21029</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545E</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB: 3,3&#39;Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-027-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-286</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (alcohol-based)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>71211</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1,250 &#956;L</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV1250-H</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 20 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-064</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-068</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered solution (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F04586</td>
			<td>Lesion plug dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (INCYTO; Disposable)</td>
			<td>SKC FILMS</td>
			<td>DHCN015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Vector Hematoxylin</td>
			<td>H-3401</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-106-01</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015-CS</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD305115</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium (VectaMount)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Size C, Plain</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431F55</td>
			<td>EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-5004</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (60ml)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>Cel culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRINGE FILTER (0.2 &#181;M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL with Luer Lock)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (145X20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4 %)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16159-798</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a patient-derived xenograft model for venous malformation

التشوه الوريدي (VM) هو شذوذ الأوعية الدموية التي تنشأ عن ضعف التنمية من الشبكة الوريدية مما أدى إلى الأوردة المتوسعة والمختلة وظيفيا في كثير من الأحيان. الغرض من هذه المقالة هو أن تصف بعناية إنشاء نموذج مورين xenograft الذي يحاكي VM الإنسان وقادرة على عكس عدم تجانس المريض. تم تحديد فرط تفعيل غير موروثة (الجسدية) TEK (TIE2) و PIK3CA الطفرات في الخلايا البطانية (EC) باعتبارها المحركات الرئيسية لتوسيع الأوعية المرضية في VM. يصف البروتوكول التالي عزل وتنقية وتوسع EC المستمدة من المريض التعبير عن متحولة TIE2 و / أو PIK3CA. يتم حقن هذه EC تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران الوثيميكية المناعية لتوليد قنوات الأوعية الدموية ectatic. الآفات المتولدة مع TIE2 أو PIK3CA-متحولة EC هي الأوعية الدموية بشكل واضح في غضون 7\u20129 أيام من الحقن وتكتل السمات الهدولوجية للأنسجة المريض VM. هذا النموذج Xenograft VM يوفر منصة موثوق بها للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تقود تشكيل الجهاز الظاهري والتوسع. وبالإضافة إلى ذلك، سيكون هذا النموذج مفيدة للدراسات الترجمية اختبار فعالية المرشحين المخدرات رواية في منع التوسع السفينة غير طبيعية ينظر في VM الإنسان.

يصف هذا البروتوكول عملية توليد نموذج مورين xenograft من VM على أساس الحقن تحت الجلد من EC المستمدة من المريض في الجزء الخلفي من الفئران العارية المناعية. يمكن حصادها مستعمرة الخلايا البطانية في غضون 4 أسابيع بعد عزل الخلايا الأولية من أنسجة الجهاز الظاهري أو الدم الآفة(الشكل 1A، B). في الي...

Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

نقدم بروتوكول مفصل لتوليد نموذج مورين xenograft من التشوه الوريدي. ويستند هذا النموذج على الحقن تحت الجلد من الخلايا البطانية المستمدة من المريض التي تحتوي على فرط تفعيل 12 و / أو الطفرات الجينية PIK3CA. Xenograft الآفات تُلخيّص عن كثب السمات الهدولوجية للأنسجة المريض VM.

نموذج Xenograft المستمدة من المريض للتشوه الوريدي

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء xenografts المستمدة من المريض التي تُكَلِمُ علم الأنسجة الهدّانات من التشوهات الوريدية. وقد سُمح لهذا أيضاً بحمل اختباراتنا العلاجية قبل الفحص. توفر هذه التقنية نظام NVivo سريع وموثوق به يسمح بالرصد اليومي لنمو الخلايا البطانية المباشرة للمريض والاستجابة للعلاج التجريبي.يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للتحقيق في أنواع أخرى من الشذوذ الوعائي أو اللمفاوي. تبدأ من خلال إعداد تعليق الخلية للحقن. تريبسينيز الخلايا البطانية مع خمسة ملليلترات من قبل warmed 0.05٪ tripsin-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.تحييد tripsin وإضافة خمسة ملليلتر من EGM وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي 150 ملليلتر. جهاز طرد مركزي إلى 400 مرات G لمدة خمس دقائق ثم pirate فائقة و resuspend الخلايا في ثلاثة ملليلتر من EGM. عد الخلايا مع قياس الهيموسيت.المغامرة في حجم مع عدد الخلية المطلوب في أنبوب جديد مخروطي 50 ملليلتر و بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي. التعرق مُندفع ترك حجم صغير لتخفيف بيليه الخلية. Resuspend بيليه الخلية مع 220 ميكرولترات من BMEM لكل حقنة.خلط تعليق الخلية جيدا على الجليد مع التأكد من تجنب خلق فقاعات. التعرق الخلية BMEM مزيج في حقنة المليلتر واحد فتح عن طريق سحب المكبس. عليك قفل إبرة معقمة قياس 26 إلى الحقنة والحفاظ على المحاقن المعدة شقة على الجليد قبل الحقن.بعد التأكد من أن الماوس قد تخدير بشكل صحيح وضعه على بطنه وتطهير منطقة الحقن مع 70٪ الإيثانول. لفة بلطف حقنة أعدت لإعادة تعليق أي خلايا استقر. فقاعات تقشر إلى نهاية الحقنة وطرد حجم صغير من تعليق الخلية.قرصة الجلد في موقع الحقن لإنشاء خيمة مثل هيكل. ثم أدخل الإبرة مباشرة تحت الجلد وتأكد من أن الإبرة هي فقط الجلد العميق عن طريق الإفراج عن الجلد قرصة لمنع الحقن في الأنسجة العضلية. عقد الإبرة باطراد حقن بعناية 200 ميكرولترات من تعليق الخلية لخلق كتلة كروية صغيرة.الحرص على تجنب حقن تعليق الخلية في العضلات. قياس طول وعرض كل قابس مع الفرجار. محاذاة المقابس xenograft تشريح على لوحة القطع بجانب مسطرة واتخاذ صورة لتسجيل الأوعية الدموية الإجمالية للآفات.ثم إصلاح المقابس عن طريق غمر لهم في 10٪ formalin بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. بعد تشريح، تتم معالجة مقابس الآفة للتحليل النسيجي وملطخة لUEA-1 للكشف عن الخلايا البطانية المشتقة من الإنسان داخل المكونات. اتخاذ خمس صور HPF لكل قسم الآفة مع المجهر الميداني مشرق في 20 X التكبير في نمط طائرة X داخل قسم الآفة لتجنب التداخل.تأكد من تضمين شريط مقياس على الصور المُتَخَذة. افتح صور HPF في الصورة J.To معايرة وحدات البكسل لشريط المقياس، واستخدم أداة الخط المستقيم واذهب فوق شريط المقياس. ثم تحويل بكسل قياس إلى ملليمترات عن طريق النقر على تحليل وتعيين مقياس.انقر بعد ذلك على تحليل مجموعة القياسات وحدد المنطقة وإضافة إلى تراكب. قياس المساحة الحقلية الإجمالية لـ HPF باستخدام تحليل وقياس حفظ هذا القياس للقياس الكمي. باستخدام أداة التحديدات من جهة حرة الخطوط العريضة يدويا قناة الأوعية الدموية UEA-1 إيجابية.انقر على تحليل وقياس لتحديد المنطقة المحددة. قياس جميع القنوات الوعائية داخل HPF. كرر العملية لـ HPF الخمسة التي تم التقاطها داخل كل قسم ثم قم بنقل القيم إلى Excel لمزيد من التحليل.ثم حساب النسبة المئوية لمنطقة الأوعية الدموية وكثافة الأوعية الدموية وفقا لاتجاهات المخطوطات. باستخدام هذا البروتوكول يتم دمج القرّة مع خلايا البطانية المتحولة المفرطة في PIK3CA في أوعية وعائية بشكل واضح في غضون سبعة إلى تسعة أيام بعد الحقن. تشبه مقابس الآفة إلى حد كبير الملامح الهستوولوجية للأنسجة الظاهرية البشرية والقنوات الوعائية الكبيرة التي تتماشى مع طبقة رقيقة من الخلايا البطانية مرئية.تحتوي هذه الهياكل الوعائية عادة على كريات الدم الحمراء التي تؤكد أنمائي وظيفي مع الأوعية الدموية الماوس المضيف. إن التلطيخ المناعي الكيميائي باستخدام الليكتانات البشرية المحددة UEA-1 يؤكد أن الخلايا التي تبطن مناطق الأوعية الدموية مشتقة من الخلايا البشرية المزروعة بدلاً من الأوعية الدموية للماوس. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تلطيخ إضافي لأقسام الآفات لعلامات الانتشار أو المبرمج لتحليل تأثيرات محددة للعلاجات التجريبية.وقد استخدم هذا النموذج scenographic للدراسات قبل السريرية من العلاجات الجديدة للتشوه الوريدي, مثل مثبطات mTOR rapamycin, التي أظهرت فعالية في العديد من التجارب السريرية لمرضى VM.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

إنشاء ذات الصلة سريريا<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; موك الساد نموذج جراحة للتحقيق الظهارية إصلاح الجرح في المكروية الأم

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

ثقافة نموذج رواية لالمحفزة الإنسان الجذعية نشر خلية على الجيلاتين في وسائل الإعلام مكيفة المشيمة-

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

علاج المخدرات و<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من خلية بناء العظم، تآكل العظام Osteoclast التفاعلات في نموذج الميداكا السمك هشاشة العظام

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

عزل السريع لBMPR-IB + الدهنية المشتقة الخلايا اللحمية للاستخدام في قبي عيب شفاء نموذج

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

تقنية إسكواش أنبوب سيمينيفيروس لتحليل الحيوانات المنوية باستخدام نموذج الماوس الخلوية

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

ظهرت مفصص الجزئي: نموذج جراحية لتجديد الكبد مورفولوجك

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

نموذج تكون العظم الهاء الماوس

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

نموذج في المختبر نظام التروية التوازي-لوحة لدراسة البكتيريا التمسك Graft الأنسجة

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...