Name: a patient-derived xenograft model for venous malformation
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Nora Lakes for korrekturlæsning. Forskning rapporteret i dette manuskript blev støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute, under Award Number R01 HL117952 (E.B.), en del af National Institutes of Health. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.

Patientvævsprøver blev indhentet fra deltagerne efter informeret samtykke fra indsamling og opbevaring af vævsprøver og data fra patienter med tumorer og vaskulære anomalier under en godkendt Institutional Review Board (IRB) pr institutionelle politikker på Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute og med godkendelse fra Udvalget for Klinisk Undersøgelse. Alle de dyreforsøg, der er beskrevet nedenfor, er blevet gennemgået og godkendt af CCHMC Institutional Animal C...

<ol>
	<li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+malformation:+update+on+aetiopathogenesis,+diagnosis+and+management.">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations.">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li><li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations.">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).</li><li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation.">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li><li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans.">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).</li><li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices.">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li><li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+Models.">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889 (2019).</li><li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts.">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li><li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+collagen,+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks.">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).</li><li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen,+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices.">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations.">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li><li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations.">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li><li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+model+for+venous+malformation.">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation.">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li><li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation.">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects.">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li></ol>

Her beskriver vi en metode til at generere en patient-afledt xenograft model af VM. Denne murine model præsenterer et fremragende system, der giver forskerne mulighed for at få en dybere forståelse af patologiske lumen udvidelsen og vil være medvirkende til at udvikle mere effektive og målrettede behandlinger til behandling af VM. Dette kan let tilpasses til at undersøge andre typer af vaskulære anomalier såsom kapillær lymfevens misdannelse16. Der er flere trin, der er afgørende for den...

Defekter i udviklingen af vaskulaturen er den underliggende årsag til mange sygdomme, herunder venøs misdannelser (VM). VM er en medfødt sygdom karakteriseret ved unormal morfogenese og udvidelse af vener1. Vigtige undersøgelser af VM-væv og endotelceller (EF) har identificeret funktionsgevinster i to gener: TEK, som koder tyrosinkinasereceptoren TIE2, og PIK3CA, som koder p110α (katalytisk underenhed) isoform af PI3-kinase (PI3K) 2,33,4,5. Disse somatiske mutationer resulterer i ligand-uafhængig hyper-aktivering af centrale angiogene/ vækst signalering veje, herunder PI3K / AKT, hvilket resulterer i udvidede ektatiske vener3. På trods af disse vigtige genetiske opdagelser, de efterfølgende cellulære og molekylære mekanismer udløser unormal angiogenese og dannelsen af udvidede vaskulære kanaler er stadig ikke fuldt forstået.
Under normal og patologisk angiogenese spirer nye fartøjer fra et allerede eksisterende vaskulært netværk, og EF gennemgår en række vigtige cellulære processer, herunder spredning, migration, ekstracellulær matrix (ECM) remodeling og lumendannelse6. To- og tredimensionelle (2D/3D) in vitro-kulturer i EF er vigtige værktøjer til at undersøge hver af disse cellulære egenskaber individuelt. Ikke desto mindre er der en klar efterspørgsel efter en musemodel, der opsummerer den patologiske fartøjsudvidelse inden for værtsmikro miljøet, samtidig med at der skabes en effektiv platform for præklinisk evaluering af målrettede lægemidler til translationel forskning.
Ajour, en transgen murine model af VM forbundet med TIE2 gain-of-function mutationer er ikke blevet rapporteret. De nuværende transgene VM-musemodeller er afhængige af det allestedsnærværende eller vævsbegrænsede udtryk for den aktiverende mutation PIK3CA p.H1047R3,5. Disse transgene dyr giver betydelig indsigt i hele kroppen eller vævsspecifikke virkninger af denne hotspot PIK3CA-mutation. Begrænsningen af disse modeller er dannelsen af et meget patologisk vaskulært netværk, der resulterer i tidlig dødelighed. Således afspejler disse musemodeller ikke fuldt ud den sporadiske forekomst af mutationshændelser og lokaliseret karakter af VM-patologi.
Tværtimod er patientbaserede xenograftmodeller baseret på transplantation eller injektion af patologisk væv eller celler fra patienter til immundefekte mus7. Xenograft modeller er et effektivt redskab til at udvide viden om sygdomsudvikling og opdagelsen af nye terapeutiske midler8. Ved hjælp af patientafledte celler kan forskerne desuden opsummere mutationsdomogeniteten for at studere spektret af patientfænotyper.
Her beskriver vi en protokol, hvor patient-afledt VM EF, som udtrykker en mutant konstituerende aktiv form for TIE2 og / eller PIK3CA injiceres subkutant i ryggen af athymiske nøgenmus. Indsprøjtede vaskulære celler suspenderes i en ECM-ramme for at fremme angiogenese som beskrevet i tidligere vaskulære xenograftmodeller9,10,11. Disse VM EF gennemgår betydelig morfogenese og genererer forstørrede, perfunderede patologiske fartøjer i mangel af understøttende celler. Den beskrevne xenograft model af VM giver en effektiv platform for præklinisk evaluering af målrettede lægemidler for deres evne til at hæmme ukontrolleret lumen ekspansion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1065</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &#181;M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>974106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>BSA</td>
			<td>A7906-50MG</td>
			<td>Cell culture; Histological analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50996491</td>
			<td>Lesion plug measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11155D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (100 &#956;M)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 241</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 239</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>21029</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545E</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB: 3,3&#39;Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-027-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-286</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (alcohol-based)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>71211</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1,250 &#956;L</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV1250-H</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 20 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-064</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-068</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered solution (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F04586</td>
			<td>Lesion plug dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (INCYTO; Disposable)</td>
			<td>SKC FILMS</td>
			<td>DHCN015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Vector Hematoxylin</td>
			<td>H-3401</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-106-01</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015-CS</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD305115</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium (VectaMount)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Size C, Plain</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431F55</td>
			<td>EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-5004</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (60ml)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>Cel culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRINGE FILTER (0.2 &#181;M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL with Luer Lock)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (145X20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4 %)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16159-798</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a patient-derived xenograft model for venous malformation

Venøs misdannelse (VM) er en vaskulær anomali, der opstår fra nedsat udvikling af venøs netværk resulterer i udvidede og ofte dysfunktionelle vener. Formålet med denne artikel er omhyggeligt at beskrive etableringen af en murine xenograft model, der efterligner menneskelige VM og er i stand til at afspejle patientens heterogenitet. Hyperaktiverende ikke-nedarvede (somatiske) TEK -mutationer (TIE2) og PIK3CA-mutationer i endotelceller (EF) er blevet identificeret som de vigtigste drivkræfter bag den patologiske fartøjsudvidelse i VM. Følgende protokol beskriver isolering, rensning og udvidelse af patientudledt EF, der udtrykker mutant TIE2 og/eller PIK3CA. Disse EF injiceres subkutisk ind i ryggen af immundefekt athymiske mus for at generere ectatic vaskulære kanaler. Læsioner genereret med TIE2 eller PIK3CA-mutant EF er synligt vaskulariseret inden for 7\u20129 dage efter injektion og opsummere histopatologiske træk af VM patientvæv. Denne VM xenograft model giver en pålidelig platform til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der driver VM-dannelse og -udvidelse. Desuden vil denne model være afgørende for translationelle undersøgelser teste effekten af nye lægemiddel kandidater i at forhindre den unormale fartøj udvidelsen set i menneskelige VM.

Denne protokol beskriver processen med at generere en murine xenograft model af VM baseret på den subkutane injektion af patient-afledte EF i ryggen af immundefekt nøgen mus. Endotelcellekolonier kan høstes inden for 4 uger efter første celleisolation fra VM-væv eller læsionalt blod (Figur 1A, B). Dagen efter injektionen dækker xenograftlæsionsproppen et overfladeareal på ca. 80\u2012100 mm2. I vores hænder er læsionsstik med TIE2/PIK3CA-mutant EC synligt vaskulære og perfunderede ...

Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Vi præsenterer en detaljeret protokol til at generere en murine xenograft model af venøs misdannelser. Denne model er baseret på subkutan injektion af patientbaserede endotelceller, der indeholder hyperaktiverende TIE2- og/eller PIK3CA-genmutationer. Xenograft læsioner nøje opsummere de histopatologiske træk ved VM patientvæv.

En Patient-Afledt Xenograft Model for Venøs misdannelser

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Denne protokol kan bruges til at skabe patient-afledte xenografts, der opsummerer histopatologien af venøse misdannelser. Dette fik yderligere lov til at bære vores prækliniske terapeutiske test. Denne teknik giver en hurtig og pålidelig NVivo system, der giver mulighed for daglig overvågning af væksten af patientens direkte endotelceller og reaktionen på eksperimentel behandling.Denne metode kan let tilpasses til at undersøge andre typer af vaskulære eller lymfeanomalier. Begynd med at forberede cellesuspensionen til injektion. Trypsinize endotelceller med fem milliliter af pre-opvarmet 0,05% tripsin-EDTA ved 37 grader Celsius i to minutter.Neutralisere tripsin og ved at tilføje fem milliliter EGM og indsamle cellerne i 150 milliliter konisk rør. Centrifuge det til 400 gange G i fem minutter derefter aspirere supernatant og resuspend cellerne i tre milliliter egm. Tæl cellerne med et hæmocytometer.Venture volumen med det ønskede cellenummer i en ny 50 milliliter konisk rør og pellet cellerne igen ved centrifugering. Inspirer supernatanten og efterlader et lille volumen for at løsne cellepellet. Opsplit cellepellet med 220 mikroliter BMEM pr. injektion.Bland cellesuspensionen grundigt på is og sørg for at undgå at skabe bobler. BMEM-cellekulturen indsuges i en 1 millilitersprøjteåbning ved at trække stemplet. Du låser en 26 gauge steril nål til sprøjten og holder de forberedte sprøjter fladt på is før injektion.Efter at have sørget for, at musen er bedøvet korrekt, skal den på maven og desinficere injektionsområdet med 70 % ethanol. Rul forsigtigt den forberedte sprøjte for at opspjænne eventuelle faste celler. Flage bobler til slutningen af sprøjten og udvise en lille mængde af celle suspension.Klem huden på injektionsstedet for at skabe et telt som struktur. Derefter indsætte nålen lige under huden og sørg for, at nålen er kun huden dyb ved at frigive knivspids hud for at forhindre injektion i muskelvæv. Hold nålen støt omhyggeligt injicere 200 mikroliter af celle suspensionen til at skabe en lille sfærisk masse.Pas på at undgå at injicere cellesuspensionen i musklen. Mål længden og bredden af hvert stik med en caliper. Juster de dissekerede xenograft-stik på et skærebræt ved siden af en lineal, og tag et billede for at registrere læsionens bruttovaskelighed.Derefter fastgør propperne ved nedsænkning dem i 10% formalin natten over ved stuetemperatur. Efter dissektion behandles læsionspropperne til histologisk analyse og farves for UEA-1 for at detektere humane afledte endotelceller i proppen. Tag fem HPF-billeder pr. læsionssektion med et lyst feltmikroskop ved 20 X forstørrelse i et X-planmønster i læsionssektionen for at undgå overlapning.Sørg for at medtage en skalalinje på de billeder, der er taget. Åbn HPF-billederne i J.To kalibrere skaleringslinjens pixel, brug værktøjet med lige linje, og gå hen over skalalinjen. Konverter derefter de målte pixel til millimeter ved at klikke på Analysér og Angiv skalering.Næste klik på Analyser sæt målinger og vælg område og føje til overlay. Mål det samlede feltområde i HPF ved hjælp af analyser og mål, lagring af denne måling til kvantificering. Brug fri hånd valg værktøj manuelt skitsere UEA-1 positiv vaskulær kanal.Klik på Analysér og mål for at kvantificere det skitserede område. Mål alle vaskulære kanaler i HPF. Gentag processen for de fem HPF-filer, der er taget i hver sektion, og overfør værdierne til Excel til yderligere analyse.Derefter beregnes procentdelen af vaskulære område og vaskulær tæthed i henhold til manuskript retninger. Ved hjælp af denne protokol er læsionspropperne med TIE2 eller PIK3CA hyperaktive mutant endotelceller synligt vaskulære og perfunderes inden for syv til ni dage efter injektionen. Læsionspropperne ligner de histopatologiske træk ved humant VM-væv, og store vaskulære kanaler justeret af et tyndt lag endotelceller er synlige.Disse vaskulære strukturer indeholder typisk erythrocytter, der bekræfter funktionel anastomose med værtsmusens vaskulatur. Immunohistokemisk farvning ved hjælp af den menneskelige specifikke lectin UEA-1 bekræfter, at cellerne foring vaskulære regioner er afledt af menneskelige implanterede celler i stedet for mus vaskulatur. Efter denne procedure, yderligere farvning af læsion sektioner for markører for spredning eller apoptose kan udføres for at analysere specifikke virkninger af eksperimentelle behandlinger.Denne scenografiske model er blevet brugt til prækliniske undersøgelser af nye behandlingsformer for venøs misdannelser, såsom mTOR-hæmmer rapamycin, som har vist effekt i flere kliniske forsøg for VM-patienter.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Etablering af en klinisk relevant<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Model for Undersøgelse Epithelial Wound Reparation i en Native mikromiljø

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

A Novel Culture Model for human Pluripotente Stem Cell Formering om Gelatine i Placenta-condition Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur af murine embryonale Mellemfodsben: en fysiologisk model af endochondral ossifikation

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug behandling og<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af Osteoblast-osteoklaster Interaktioner i en Medaka Fish Osteoporose Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Hurtig Isolering af BMPR-IB + Adipose-afledte stromaceller til brug i en calvariale Defekt Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation af iPSC-afledte menneskelige hjerne organoider til Model Tidlig forstyrrelser i nervesystemets

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

En Seminiferous tubulus Squash teknik til cytologiske analyse af spermatogenesen ved hjælp af musen Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Delvis dråbeformede Hepatectomy: En kirurgisk Model for morfologiske lever regenerering

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

En mus distraktion Osteogenesis Model

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

En In Vitro Model af en Parallel-plade Perfusion System at studere bakteriel tilslutning til at pode væv

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...