Name: a patient-derived xenograft model for venous malformation
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Nora Lakes pour la relecture. La recherche rapportée dans ce manuscrit a été soutenue par le National Heart, Lung, and Blood Institute, sous le numéro de prix R01 HL117952 (E.B.), qui fait partie des National Institutes of Health. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Des échantillons de tissus de patients ont été obtenus auprès des participants après le consentement éclairé de la collection et du dépôt d’échantillons de tissus et de données de patients atteints de tumeurs et d’anomalies vasculaires dans le cadre d’un Comité d’examen institutionnel (CISR) approuvé par les politiques institutionnelles du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC), du Cancer and Blood Disease Institute et avec l’approbation du Comité d’enquête clinique. Toutes les...

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	<li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices.">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li><li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+Models.">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889 (2019).</li><li>Byrne, A. 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T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen,+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices.">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations.">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li><li>Marler, J. J., Mulliken, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation.">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects.">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li></ol>

Ici, nous décrivons une méthode pour générer un modèle xénogreffe de VM dérivé du patient. Ce modèle murin présente un excellent système qui permet aux chercheurs d’acquérir une compréhension plus profonde de l’élargissement pathologique des lumens et jouera un rôle déterminant dans le développement de thérapies plus efficaces et ciblées pour le traitement de la VM. Ceci peut être facilement adapté pour étudier d’autres types d’anomalies vasculaires telles que la malformation veineuse lympha...

Les défauts dans le développement de la vascularisation sont la cause sous-jacente de nombreuses maladies, y compris la malformation veineuse (VM). VM est une maladie congénitale caractérisée par la morphogenèse anormale et l’expansion des veines1. Des études importantes sur les tissus VM et les cellules endothéliales (EC) ont identifié des mutations de gain de fonction dans deux gènes : TEK, qui code le récepteur de la tyrosine kinase TIE2, et PIK3CA, qui code l’isoforme p110α (sous-unité catalytique) de PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5. Ces mutations somatiques entraînent une hyperactivation ligand-indépendante des voies de signalisation angiogéniques/de croissance clés, y compris PI3K/AKT, ce qui entraîne des veines ecstatiques dilatées3. Malgré ces découvertes génétiques importantes, les mécanismes cellulaires et moléculaires suivants déclenchant l’angiogenèse anormale et la formation de canaux vasculaires agrandis ne sont toujours pas entièrement compris.
Pendant l’angiogenèse normale et pathologique, de nouveaux vaisseaux germent d’un réseau vasculaire préexistant et EC subissent une séquence de processus cellulaires importants comprenant la prolifération, la migration, le remodelage de matrice extracellulaire (ECM) et la formation de lumen6. Les cultures in vitro bidimensionnelles (2D/3D) d’EC sont des outils importants pour étudier chacune de ces propriétés cellulaires individuellement. Néanmoins, il existe une demande claire pour un modèle de souris récapitulant l’élargissement pathologique des vaisseaux dans le microenvironnement hôte tout en fournissant une plate-forme efficace pour l’évaluation préclinique des médicaments ciblés pour la recherche translationnelle.
À ce jour, un modèle murin transgénique de VM associé aux mutations de gain de fonction tie2 n’a pas été rapporté. Les modèles transgéniques actuels de souris VM s’appuient sur l’expression omniprésente ou restreinte de tissu de la mutation activante PIK3CA p.H1047R3,5. Ces animaux transgéniques fournissent un aperçu significatif des effets spécifiques au corps entier ou aux tissus de cette mutation PIK3CA de point chaud. La limitation de ces modèles est la formation d’un réseau vasculaire hautement pathologique ayant pour résultat la létalité tôt. Ainsi, ces modèles de souris ne reflètent pas entièrement l’occurrence sporadique des événements mutationnels et de la nature localisée de la pathologie de VM.
Au contraire, les modèles de xénogreffe dérivés par le patient sont basés sur la transplantation ou l’injection de tissus pathologiques ou de cellules dérivées de patients sur des souris immunodéficientes7. Les modèles Xénogreffe sont un outil puissant pour élargir les connaissances sur le développement des maladies et la découverte de nouveaux agents thérapeutiques8. En outre, l’utilisation de cellules dérivées du patient permet aux scientifiques de récapituler l’hétérogénéité de mutation pour étudier le spectre des phénotypes de patients.
Ici, nous décrivons un protocole où les VM EC dérivés du patient qui expriment une forme mutante constitutivement active de TIE2 et/ou PIK3CA sont injectés sous-cutanéement dans le dos de souris nues athymiques. Les cellules vasculaires injectées sont suspendues dans un cadre ecm afin de promouvoir l’angiogenèse comme décrit dans les modèles xénogreffe vasculaires précédentes9,10,11. Ces EC de VM subissent la morphogenèse significative et génèrent des vaisseaux pathologiques agrandis et perfusés en l’absence de cellules de soutien. Le modèle de xénogreffe décrit de VM fournit une plate-forme efficace pour l’évaluation préclinique des drogues ciblées pour leur capacité à inhiber l’expansion incontrôlée de lumen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>069(nu)/070(nu/+)</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1065</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &#181;M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>974106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>BSA</td>
			<td>A7906-50MG</td>
			<td>Cell culture; Histological analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50996491</td>
			<td>Lesion plug measurment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11155D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (100 &#956;M)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 241</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>07 000 239</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>21029</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545E</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB: 3,3&#39;Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-027-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-286</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (alcohol-based)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>71211</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1,250 &#956;L</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV1250-H</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 20 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-064</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-068</td>
			<td>Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered solution (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F04586</td>
			<td>Lesion plug dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (INCYTO; Disposable)</td>
			<td>SKC FILMS</td>
			<td>DHCN015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Vector Hematoxylin</td>
			<td>H-3401</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>59399-106-01</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1880-500G</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>EC separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015-CS</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD305115</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium (VectaMount)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle Size C, Plain</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431F55</td>
			<td>EC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-5004</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (60ml)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>Cel culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRINGE FILTER (0.2 &#181;M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL with Luer Lock)</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plate (145X20 mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701119</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4 %)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16159-798</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histological anlaysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a patient-derived xenograft model for venous malformation

La malformation veineuse (VM) est une anomalie vasculaire qui résulte d’une altération du développement du réseau veineux entraînant des veines dilatées et souvent dysfonctionnelles. Le but de cet article est de décrire soigneusement l’établissement d’un modèle de xénogreffe murine qui imite VM humaine et est capable de refléter l’hétérogénéité du patient. Les mutations TEK (TIE2) non héréditaires (somatiques) et PIK3CA dans les cellules endothéliales (EC) ont été identifiées comme les principaux moteurs de l’élargissement pathologique des vaisseaux dans la VM. Le protocole suivant décrit l’isolement, la purification et l’expansion des EC d’origine du patient exprimant le mutant TIE2 et/ou PIK3CA. Ces EC sont injectées sous-cutanéement dans le dos des souris athymiques immunodéficientes pour générer des canaux vasculaires ectatiques. Les lésions générées avec TIE2 ou PIK3CA-mutant EC sont visiblement vascularisées dans les 7\u20129 jours suivant l’injection et récapitulent les caractéristiques histopathologiques du tissu patient de VM. Ce modèle VM xenograft fournit une plate-forme fiable pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant la formation et l’expansion de VM. En outre, ce modèle sera instrumental pour des études translationnelles testant l’efficacité des nouveaux candidats de drogue dans la prévention de l’agrandissement anormal de navire vu dans VM humain.

Ce protocole décrit le processus de génération d’un modèle de xénogreffe murine de VM basé sur l’injection sous-cutanée de l’EC patient-dérivé dans le dos des souris nues immunodéficientes. Les colonies de cellules endothéliales peuvent être récoltées dans les 4 semaines suivant l’isolement initial des cellules du tissu VM ou du sang lésionnel (figure 1A,B). Le lendemain de l’injection, le bouchon de lésion xénogreffe couvre une surface d’environ 80\u2012100 mm2. D...

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A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Nous présentons un protocole détaillé pour générer un modèle de xénogreffe murine de malformation veineuse. Ce modèle est basé sur l’injection sous-cutanée de cellules endothéliales dérivées du patient contenant des mutations du gène TIE2 hyper-activantes et/ou PIK3CA. Les lésions de Xenograft récapitulent étroitement les dispositifs histopathologiques du tissu patient de VM.

Un modèle xénogreffe dérivé par le patient pour la malformation veineuse

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Ce protocole peut être employé pour créer les xénogreffes patient-dérivées qui récapitulent l’histopathologie des malformations veineux. Cela a également été autorisé à effectuer nos tests thérapeutiques précliniques. Cette technique fournit un système NVivo rapide et fiable qui permet une surveillance quotidienne de la croissance des cellules endothéliales directes du patient et de la réponse à la thérapie expérimentale.Cette méthode pourrait être facilement adaptée pour étudier d’autres types d’anomalies vasculaires ou lymphatiques. Commencez par préparer la suspension cellulaire pour injection. Essayez de trypsiniser les cellules endothéliales avec cinq millilitres de préchauffé 0,05%tripsin-EDTA à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.Neutraliser le tripsin et en ajoutant cinq millilitres d’EGM et de recueillir les cellules en tube conique de 150 millilitres. Centrifugez-le à 400 fois G pendant cinq minutes puis aspirez le supernatant et resuspendez les cellules en trois millilitres d’EGM. Comptez les cellules à l’amiomètre.Aventurez le volume avec le numéro de cellule désiré dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et pelletez à nouveau les cellules par centrifugation. Aspirer le supernatant en laissant un petit volume pour desserrer la pastille cellulaire. Resuspendez la pastille cellulaire avec 220 microlitres de BMEM par injection.Bien mélanger la suspension cellulaire sur la glace en s’assurant d’éviter de créer des bulles. Aspirez le mélange de culture cellulaire BMEM dans une ouverture de seringue d’un millilitre en tirant le piston. Vous verrouillez une aiguille stérile de calibre 26 à la seringue et garderez les seringues préparées à plat sur la glace avant l’injection.Après s’être assuré que la souris a correctement anesthésié placez-la sur son estomac et désinfectez la région d’injection avec 70% d’éthanol. Roulez doucement la seringue préparée pour résusuer les cellules réglées. Flocons de bulles à l’extrémité de la seringue et expulser un petit volume de la suspension cellulaire.Pincez la peau au site d’injection pour créer une tente comme la structure. Ensuite, insérez l’aiguille juste sous la peau et assurez-vous que l’aiguille n’est que la peau profonde en libérant la peau pincer pour empêcher l’injection dans le tissu musculaire. Tenir l’aiguille régulièrement injecter soigneusement 200 microlitres de la suspension cellulaire pour créer une petite masse sphérique.Prenez soin d’éviter d’injecter la suspension cellulaire dans le muscle. Mesurez la longueur et la largeur de chaque prise à l’l’insurmater. Alignez les bouchons de xénogreffe disséqués sur une planche à découper à côté d’une règle et prenez une image pour enregistrer la vascularité brute des lésions.Ensuite, fixez les bouchons en les vantant en formaline de 10% pendant la nuit à température ambiante. Après dissection, les bouchons de lésion sont traités pour l’analyse histologique et tachés pour UEA-1 pour détecter les cellules endothéliales dérivées de l’homme dans le bouchon. Prenez cinq images HPF par section de lésion avec un microscope de champ lumineux à 20 X grossissement dans un modèle de plan X dans la section de lésion pour éviter le chevauchement.Assurez-vous d’inclure une barre d’échelle sur les images prises. Ouvrez les images HPF dans l’image J.To calibrer les pixels de la barre d’échelle, utiliser l’outil en ligne droite et passer au-dessus de la barre d’échelle. Convertissez ensuite les pixels mesurés en millimètres en cliquant sur Analyser et définir l’échelle.Cliquez ensuite sur Analyser les mesures définies et sélectionner la zone et ajouter à la superposition. Mesurez la superficie totale du FPH à l’aide de l’analyse et de la mesure en sauvant cette mesure pour la quantification. À l’aide de l’outil de sélection des mains libres, décrire manuellement le canal vasculaire positif UEA-1.Cliquez sur Analyser et mesurer pour quantifier la zone décrite. Mesurer tous les canaux vasculaires dans le HPF. Répétez le processus pour les cinq HPF pris dans chaque section et transférez les valeurs à Excel pour une analyse plus approfondie.Calculez ensuite le pourcentage de zone vasculaire et de densité vasculaire selon les instructions manuscrites. En utilisant ce protocole, les bouchons de lésion avec tie2 ou PIK3CA cellules endothéliales mutantes hyperactives sont visiblement vascularisés et perfusés dans les sept à neuf jours après l’injection. Les bouchons de lésion ressemblent étroitement aux dispositifs histopathologiques du tissu humain de VM et de grands canaux vasculaires alignés par une fine couche des cellules endothéliales sont visibles.Ces structures vasculaires contiennent généralement des érythrocytes confirmant l’anastomose fonctionnelle avec la vascularisation de souris hôte. La coloration immunohistochimique utilisant la lectine spécifique humaine UEA-1 confirme que les cellules tapissant des régions vasculaires sont dérivées des cellules implantées humaines plutôt que de la vascularisation de souris. Après cette procédure, la coloration supplémentaire des sections de lésion pour des marqueurs de prolifération ou d’apoptose peut être exécutée pour analyser des effets spécifiques des traitements expérimentaux.Ce modèle scénographique a été utilisé pour des études précliniques de nouvelles thérapies pour la malformation veineuse, comme l’inhibiteur du mTOR rapamycine, qui a montré son efficacité dans plusieurs essais cliniques pour les patients atteints de VM.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Création d&#39;une importance clinique<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Chirurgie de la cataracte modèle pour étudier épithéliale Wound Repair dans un microenvironnement maternelle

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Recherche

Biologie du développement

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

A Novel Culture Modèle de cellules souches pluripotentes humaines Propagation de gélatine dans les médias Placenta conditionné

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture de murines embryonnaires Métatarsiens: un modèle physiologique de endochondrale ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

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Traitement de la toxicomanie et<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie des ostéoblastes-ostéoclastes Interactions dans un modèle Medaka poisson Ostéoporose

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Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

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A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

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An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

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